Profilage de l'expression par microréseaux

Un microréseau d'ADN mesure l'expression génique en hybridant des acides nucléiques marqués d'un échantillon à une grille dense et ordonnée de sondes complémentaires fixées sur une surface solide ; la fluorescence à chaque sonde reflète la quantité de transcrit correspondant présent. Les microréseaux ont rendu le profilage d'expression à l'échelle du génome courant à la fin des années 1990 et dans les années 2000 et demeurent une plateforme définie et rentable lorsque l'ensemble des transcrits à mesurer est connu à l'avance.

Definition

Le profilage d'expression basé sur les microréseaux quantifie l'abondance des transcrits en mesurant le signal d'hybridation d'acides nucléiques d'échantillon marqués à un réseau fixe de sondes d'ADN complémentaire ou d'oligonucléotides, produisant une valeur d'expression relative pour chaque gène sondé.

Scope

Ce sujet couvre la conception et l'utilisation des microréseaux d'expression : la disposition des sondes, le marquage des échantillons et l'hybridation, l'acquisition de signaux basée sur l'image, ainsi que la normalisation et la synthèse nécessaires pour transformer les intensités brutes des sondes en valeurs d'expression comparables. Il s'agit d'une référence méthodologique en transcriptomique et n'offre aucune orientation clinique.

Core questions

• Comment les sondes sont-elles conçues et agencées pour représenter les gènes d'intérêt ?
• Comment le signal d'hybridation est-il lié à l'abondance des transcrits ?
• Comment les intensités brutes des sondes sont-elles normalisées et synthétisées en valeurs d'expression par gène ?
• Quand un microréseau à sondes fixes est-il préférable au séquençage direct des transcrits ?

Key concepts

• Conception des sondes et des microréseaux
• Hybridation et marquage fluorescent
• Microréseaux à deux couleurs versus à canal unique
• Correction du bruit de fond et normalisation
• Synthèse au niveau des sondes (par ex., RMA)
• Hybridation croisée et saturation
• Ensemble de sondes fixe (mesure fermée)

Mechanisms

L'ADN ou l'ARN complémentaire marqué préparé à partir d'un échantillon est appliqué sur un microréseau sur lequel des milliers de sondes de séquence connue sont fixées à des positions adressables. Les molécules complémentaires s'hybrident à leurs sondes, et un scanner enregistre l'intensité de fluorescence à chaque spot, ce qui est considéré comme une mesure relative de l'abondance du transcrit correspondant. Étant donné que l'intensité est affectée par le bruit de fond, l'affinité des sondes et la variation d'un microréseau à l'autre, les signaux bruts doivent être corrigés du bruit de fond, normalisés entre les microréseaux et synthétisés à partir de plusieurs sondes par gène en une seule estimation d'expression ; la méthode Robust Multi-array Average (RMA) d'Irizarry et ses collègues est un cadre de synthèse largement utilisé. Schena et ses collègues ont introduit le microréseau d'ADNc, et Lockhart et ses collègues ont établi les microréseaux d'oligonucléotides à haute densité comme plateforme quantitative de surveillance de l'expression.

Clinical relevance

Les microréseaux ont produit des classifications moléculaires influentes des maladies et ont été la plateforme à l'origine de plusieurs signatures d'expression génique précoces utilisées dans des contextes de recherche et translationnels. En tant que sujet de référence, cette entrée explique comment les preuves d'expression basées sur les microréseaux sont générées et normalisées ; elle n'est pas une base pour des décisions diagnostiques ou thérapeutiques individuelles.

Evidence & guidelines

Les fondements méthodologiques sont les articles fondateurs de Schena et ses collègues (microréseaux d'ADNc) et de Lockhart et ses collègues (microréseaux d'oligonucléotides), ainsi que les méthodes de normalisation et de synthèse telles que RMA (Irizarry et ses collègues). Ce sont des références méthodologiques plutôt que des directives cliniques.

History

Les microréseaux d'expression ont été introduits au milieu des années 1990, Schena et ses collègues démontrant un microréseau d'ADNc en 1995 et Lockhart et ses collègues décrivant des microréseaux d'oligonucléotides à haute densité en 1996. Au cours de la décennie suivante, les microréseaux sont devenus l'outil dominant pour les études d'expression à l'échelle du génome, et les méthodes statistiques de normalisation et de synthèse des sondes ont mûri. À partir de la fin des années 2000, le séquençage de l'ARN a progressivement supplanté les microréseaux pour les travaux de découverte, bien que les microréseaux aient persisté là où un ensemble de sondes défini et un coût inférieur étaient avantageux.

Debates

Microréseaux versus séquençage de l'ARN

Les microréseaux ne mesurent que les transcrits représentés par leurs sondes fixes et ont une gamme dynamique plus étroite, tandis que le séquençage mesure les transcrits directement et peut en découvrir de nouveaux ; le compromis entre un dosage fermé défini et moins cher et une plateforme de découverte ouverte continue d'influencer le choix de la plateforme.

Key figures

• Patrick O. Brown
• Mark Schena
• David J. Lockhart
• Rafael Irizarry

Seminal works

• schena-1995
• lockhart-1996
• irizarry-2003

Frequently asked questions

Pourquoi un microréseau ne peut-il mesurer que les transcrits pour lesquels il a été conçu ?

Le signal provient de l'hybridation à des sondes de séquence connue fixées sur le microréseau, donc tout transcrit sans sonde correspondante ne peut pas être détecté. Cela fait des microréseaux un dosage fermé, contrairement au séquençage, qui échantillonne directement les transcrits.

À quoi sert la normalisation dans les données de microréseaux ?

Elle ajuste les variations techniques telles que les différences de bruit de fond, d'efficacité de marquage et d'intensité d'un microréseau à l'autre, afin que les valeurs d'expression résultantes reflètent des différences biologiques plutôt que des artefacts expérimentaux.