Méthodes de séquençage de l'ADN et de l'ARN

Les méthodes de séquençage déterminent l'ordre précis des nucléotides dans l'ADN ou, après conversion, dans l'ARN. De la chimie de terminaison de chaîne de Sanger aux plateformes de nouvelle génération massivement parallèles, ces techniques permettent à la pathologie moléculaire de lire les gènes base par base, de détecter les mutations et de profiler l'expression génique à grande échelle.

Definition

Les méthodes de séquençage de l'ADN et de l'ARN sont des techniques de laboratoire qui lisent l'ordre linéaire des bases nucléotidiques dans une molécule d'acide nucléique ; l'ARN est généralement rétrotranscrit en ADN complémentaire avant le séquençage.

Scope

Ce sujet couvre le séquençage de première génération (Sanger), le séquençage de nouvelle génération (massivement parallèle) et le séquençage de l'ARN pour l'analyse du transcriptome, ainsi que le flux de travail général de préparation de librairies, de séquençage et d'alignement des lectures. Il est présenté comme un matériel de référence méthodologique plutôt que comme un guide de tests cliniques.

Key concepts

• Séquençage par terminaison de chaîne (Sanger)
• Séquençage de nouvelle génération / massivement parallèle
• Préparation de librairies
• Lectures de séquençage et couverture
• Alignement des lectures et appel de variants
• Séquençage de l'ARN (transcriptomique)
• Séquençage ciblé, de l'exome et du génome entier

Mechanisms

Le séquençage de Sanger incorpore des didésoxyribonucléotides terminateurs de chaîne pour générer des fragments de toutes longueurs, qui sont séparés par taille pour reconstituer la séquence (Sanger et al., 1977). Le séquençage de nouvelle génération prépare plutôt une librairie d'ADN fragmenté, l'amplifie spatialement et séquence des millions de fragments en parallèle, lisant de courtes séquences dont les signaux sont assemblés par calcul (Margulies et al., 2005 ; Goodwin et al., 2016). Le séquençage de l'ARN applique la même approche parallèle à l'ADN complémentaire dérivé de l'ARN, quantifiant les transcrits et révélant les motifs d'épissage et d'expression (Wang et al., 2009). Les lectures sont alignées sur une référence pour identifier les variants ou mesurer l'abondance.

Clinical relevance

Le séquençage soutient la détection des variants associés aux maladies et la caractérisation moléculaire des tumeurs et des agents pathogènes. Cette entrée explique comment les méthodes génèrent des données de séquence et est destinée à servir de référence ; elle ne fournit pas de conseils sur la sélection, l'interprétation ou l'action à entreprendre concernant les tests de séquençage dans le cadre des soins individuels aux patients.

Evidence & guidelines

Les méthodes reposent sur une littérature primaire fondamentale, depuis la méthode de terminaison de chaîne de Sanger en 1977, en passant par la première plateforme picolitre à haut débit (Margulies et al., 2005) et la séquence du génome humain (Venter et al., 2001), avec des revues ultérieures examinant une décennie de technologies de nouvelle génération et l'essor du RNA-Seq (Goodwin et al., 2016 ; Wang et al., 2009).

History

La méthode de terminaison de chaîne de Sanger (1977) a rendu le séquençage de l'ADN courant et a servi de base au premier séquençage du génome humain (Venter et al., 2001). L'introduction du séquençage massivement parallèle au milieu des années 2000 a considérablement réduit les coûts et augmenté le débit (Margulies et al., 2005), et en une décennie, le séquençage de nouvelle génération et le RNA-Seq sont devenus des outils standards pour la génomique et la transcriptomique (Goodwin et al., 2016 ; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

En quoi le séquençage de nouvelle génération diffère-t-il du séquençage de Sanger ?

Le séquençage de Sanger lit un fragment d'ADN à la fois en utilisant une chimie de terminaison de chaîne, tandis que le séquençage de nouvelle génération lit des millions de fragments simultanément de manière massivement parallèle, augmentant considérablement le débit et réduisant le coût par base.

L'ARN peut-il être séquencé directement ?

L'ARN est généralement d'abord converti en ADN complémentaire par rétrotranscription, puis séquencé ; cette approche de RNA-Seq quantifie les transcrits et révèle les motifs d'épissage et d'expression.