DNA和RNA测序方法

测序方法确定DNA中核苷酸的精确顺序，或在转化后确定RNA中核苷酸的精确顺序。从Sanger的链终止化学法到大规模并行下一代平台，这些技术使分子病理学能够逐个碱基读取基因，检测突变，并大规模分析基因表达。

Definition

DNA和RNA测序方法是读取核酸分子中核苷酸碱基线性顺序的实验室技术；RNA通常在测序前逆转录为互补DNA。

Scope

本主题涵盖第一代（Sanger）测序、下一代（大规模并行）测序和用于转录组分析的RNA测序，以及文库制备、测序和读段比对的一般工作流程。它作为方法学参考材料而非临床检测指南呈现。

Key concepts

• 链终止（Sanger）测序
• 下一代/大规模并行测序
• 文库制备
• 测序读段和覆盖度
• 读段比对和变异检测
• RNA测序（转录组学）
• 靶向、外显子组和全基因组测序

Mechanisms

Sanger测序通过掺入链终止双脱氧核苷酸来生成各种长度的片段，这些片段通过大小分离以重建序列（Sanger et al., 1977）。下一代测序则制备片段化DNA文库，对其进行空间扩增，并并行测序数百万个片段，读取短序列，其信号通过计算组装（Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016）。RNA测序将相同的并行方法应用于源自RNA的互补DNA，量化转录本并揭示剪接和表达模式（Wang et al., 2009）。读段与参考序列比对以识别变异或测量丰度。

Clinical relevance

测序支持疾病相关变异的检测以及肿瘤和病原体的分子表征。本条目解释了这些方法如何生成序列数据，旨在作为参考；它不就个体患者护理中测序测试的选择、解释或行动提供建议。

Evidence & guidelines

这些方法建立在基础的原始文献之上，从Sanger的1977年链终止方法到第一个高通量皮升平台（Margulies et al., 2005）和人类基因组序列（Venter et al., 2001），后来的综述回顾了十年来的下一代技术和RNA-Seq的兴起（Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009）。

History

Sanger的链终止方法（1977）使DNA测序成为常规，并支撑了人类基因组的首次测序（Venter et al., 2001）。2000年代中期大规模并行测序的引入显著降低了成本并提高了通量（Margulies et al., 2005），在十年内，下一代测序和RNA-Seq已成为基因组学和转录组学的标准工具（Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009）。

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

下一代测序与Sanger测序有何不同？

Sanger测序使用链终止化学法一次读取一个DNA片段，而下一代测序以大规模并行方式同时读取数百万个片段，大大提高了通量并降低了每个碱基的成本。

RNA可以直接测序吗？

RNA通常首先通过逆转录转化为互补DNA，然后进行测序；这种RNA-Seq方法量化转录本并揭示剪接和表达模式。