Молекулярная диагностика: ПЦР, ОТ-ПЦР и амплификация нуклеиновых кислот

Молекулярная диагностика выявляет вирус путем амплификации и идентификации его нуклеиновой кислоты. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и, для РНК-вирусов, обратнотранскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР) копируют целевую последовательность генома миллионы раз, так что даже очень малые количества вирусного генома становятся обнаруживаемыми. Это придает данным методам высокую чувствительность и специфичность, делая их основой современной вирусной диагностики.

Definition

Молекулярная диагностика — это обнаружение и, при необходимости, количественное определение вирусной нуклеиновой кислоты с помощью методов амплификации, таких как ПЦР, ОТ-ПЦР и изотермические методы, которые копируют специфическую геномную мишень до обнаруживаемых уровней.

Scope

Данная тема охватывает методы амплификации нуклеиновых кислот, используемые в вирусологии: обычную и ПЦР в реальном времени, ОТ-ПЦР для РНК-вирусов, количественное измерение вирусной нагрузки и изотермические альтернативы, такие как петлевая изотермическая амплификация. В ней объясняются принципы и интерпретация на справочном уровне, но не приводятся протоколы анализов или рекомендации по клиническому ведению.

Core questions

• Как амплификация целевой последовательности позволяет обнаружить вирус из крошечного исходного количества?
• Какой дополнительный этап требуется для РНК-вируса по сравнению с ДНК-вирусом?
• Как ПЦР в реальном времени используется для количественного определения вирусной нагрузки и что означает пороговый цикл?
• Когда изотермические или мультиплексные форматы предпочтительнее обычной ПЦР?

Key concepts

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
• Обратная транскрипция (ОТ-ПЦР)
• Праймеры и специфичность мишени
• Термоциклирование и экспоненциальная амплификация
• ПЦР в реальном времени (количественная)
• Пороговый цикл и вирусная нагрузка
• Мультиплексная амплификация
• Изотермическая амплификация (например, LAMP)

Mechanisms

ПЦР использует два коротких праймера, фланкирующих выбранную область вирусного генома, термостабильную ДНК-полимеразу и повторяющиеся циклы нагревания и охлаждения. Каждый цикл денатурирует ДНК, отжигает праймеры и удлиняет новые цепи, удваивая мишень, так что она накапливается экспоненциально. Для РНК-вирусов этап обратной транскрипции сначала превращает РНК-геном в комплементарную ДНК перед амплификацией. ПЦР в реальном времени отслеживает накопление продукта цикл за циклом с использованием флуоресцентных репортеров, что позволяет проводить количественное определение: пороговый цикл, при котором сигнал поднимается выше фонового уровня, обратно пропорционален количеству исходной матрицы, что дает оценку вирусной нагрузки. Мультиплексные схемы амплифицируют несколько мишеней одновременно, а изотермические методы, такие как петлевая изотермическая амплификация, достигают амплификации при постоянной температуре, снижая требования к приборам для децентрализованного тестирования.

Clinical relevance

Амплификация нуклеиновых кислот обеспечивает чувствительное и специфичное обнаружение активной вирусной инфекции и поддерживает мониторинг вирусной нагрузки, используемый для отслеживания инфекций и ответа на лечение. Данная статья описывает, как работают методы и как в принципе интерпретируются такие результаты, как пороговый цикл, включая тот факт, что обнаружение генома само по себе не доказывает присутствие инфекционного вируса; она носит описательный характер методологии и не является основанием для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

Epidemiology

ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией стала референсным методом для подтверждения инфекции SARS-CoV-2, а быстрая публикация валидированных анализов в начале 2020 года позволила глобально масштабировать молекулярное тестирование, что иллюстрирует, как амплификация нуклеиновых кислот лежит в основе обнаружения и эпиднадзора за вспышками.

History

Полимеразная цепная реакция была задумана Кэри Муллисом и впервые применена для генетической диагностики Сайки и коллегами в 1985 году, а метод был формализован Муллисом и Фалуной в 1987 году. Количественная ПЦР в реальном времени, описанная Хайдом и коллегами в 1996 году, добавила непрерывное количественное определение, а изотермические методы, такие как петлевая изотермическая амплификация, представленные Нотоми и коллегами в 2000 году, расширили возможности проведения амплификации.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

В чем разница между ПЦР и ОТ-ПЦР?

ПЦР амплифицирует ДНК, поэтому она непосредственно используется для ДНК-вирусов. ОТ-ПЦР добавляет этап обратной транскрипции, который сначала превращает РНК-геном вируса в комплементарную ДНК, что позволяет обнаруживать РНК-вирусы, такие как вирусы гриппа и коронавирусы.

Означает ли положительный результат ПЦР наличие инфекционного вируса?

Не обязательно. ПЦР обнаруживает вирусный геном, который может сохраняться после того, как вирус перестает реплицироваться или быть инфекционным. Установление присутствия инфекционного вируса требует культивирования или других функциональных анализов, интерпретируемых в клиническом контексте.