Молекулярная диагностика: ПЦР и секвенирование

Молекулярные методы обнаруживают и идентифицируют грибы по их нуклеиновым кислотам, а не по росту или внешнему виду. Полимеразная цепная реакция амплифицирует грибковую ДНК из образцов или изолятов, а секвенирование консервативных областей, особенно внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомальных генов, считывает амплифицированную ДНК для идентификации организма, часто быстрее и точнее, чем культуральный метод.

Definition

Молекулярная диагностика грибов — это методы, которые амплифицируют и анализируют грибковые нуклеиновые кислоты, используя ПЦР для обнаружения грибковой ДНК и секвенирование ДНК консервативных областей, таких как внутренний транскрибируемый спейсер, для идентификации организма до рода или вида.

Scope

Эта тема охватывает видоспецифичную и широкодиапазонную (панфунгальную) ПЦР, ПЦР в реальном времени, секвенирование ДНК баркодирующих регионов, таких как ITS, и использование этих методов для культуральных изолятов и непосредственно для клинического материала, включая фиксированную формалином ткань. Она рассматривает их как методы идентификации и обнаружения и не содержит инструкций по тестированию или лечению.

Core questions

• Присутствует ли грибковая ДНК в этом образце, и от какого организма она происходит?
• Когда широкодиапазонная панфунгальная ПЦР предпочтительнее видоспецифического анализа?
• Какой геномный регион лучше всего различает интересующие грибы?
• Как интерпретировать молекулярные результаты, учитывая риски контаминации и обнаружения нежизнеспособной ДНК?

Key concepts

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
• Видоспецифичная против широкодиапазонной (панфунгальной) ПЦР
• ПЦР в реальном времени (количественная)
• Внутренний транскрибируемый спейсер (ITS) как грибковый штрих-код
• Секвенирование ДНК и референсные базы данных
• Обнаружение на изолятах против прямого обнаружения на ткани
• Контроль контаминации и интерпретация внеклеточной ДНК

Mechanisms

ПЦР использует праймеры и термостабильную полимеразу для амплификации целевой ДНК посредством повторяющихся циклов, генерируя достаточно копий для обнаружения даже небольших количеств грибкового генетического материала. Видоспецифичные анализы нацелены на известный организм, в то время как широкодиапазонные или панфунгальные анализы используют праймеры против консервативных областей, общих для многих грибов, после чего секвенирование выявляет идентичность. Область внутреннего транскрибируемого спейсера кластера генов рибосомальной РНК, фланкированная консервативными праймерами, описанными Уайтом и коллегами, достаточно вариабельна между видами, чтобы служить универсальным грибковым штрих-кодом, а последовательность считывания сопоставляется с референсными базами данных для идентификации организма. ПЦР в реальном времени добавляет количественную оценку и скорость, и анализы могут проводиться на культивированных изолятах или непосредственно на клинических образцах, включая фиксированную формалином ткань, хотя деградированная ДНК и загрязнение окружающей среды усложняют интерпретацию. Поскольку ПЦР обнаруживает ДНК, а не жизнеспособные клетки, результаты интерпретируются совместно с данными культурального исследования, микроскопии и обнаружения антигенов.

Clinical relevance

Молекулярное обнаружение и секвенирование все чаще лежат в основе идентификации грибов и распознавания некоторых инфекций, а определенные результаты ПЦР способствуют формированию консенсусных категорий вероятного инвазивного грибкового заболевания. Данная статья описывает методы и их интерпретационные оговорки в качестве справочного материала и не содержит указаний по тестированию или уходу за пациентами.

Evidence & guidelines

Консенсусные определения EORTC/MSGERC включают указанные результаты ПЦР среди микологических критериев вероятного инвазивного грибкового заболевания, что отражает развитие молекулярных методов, в то время как рекомендации по передовой практике описывают их место наряду с культуральным исследованием и тестированием на антигены. Подход секвенирования ITS восходит к широко используемым праймерам, опубликованным Уайтом и коллегами.

History

После разработки полимеразной цепной реакции в 1980-х годах ее применение к грибам быстро развивалось, когда Уайт и коллеги опубликовали в 1990 году праймеры для амплификации и прямого секвенирования грибковых генов рибосомальной РНК, установив область ITS в качестве филогенетического, а затем и диагностического маркера. ПЦР в реальном времени, широкодиапазонные панфунгальные анализы и высокопроизводительное секвенирование впоследствии расширили молекулярную микологию от исследований до рутинной идентификации и обнаружения.

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

Что такое область ITS и почему она используется для идентификации грибов?

Внутренний транскрибируемый спейсер (ITS) — это часть кластера грибковых рибосомальных генов, которая достаточно сильно варьирует между видами, при этом фланкирована консервативными последовательностями, что делает ее практичным универсальным штрих-кодом для идентификации грибов на основе секвенирования.

Доказывает ли положительный результат ПЦР на грибы активную инфекцию?

Не сама по себе. ПЦР обнаруживает грибковую ДНК, которая может сохраняться после того, как организмы перестали быть жизнеспособными, или возникать из-за контаминации, поэтому молекулярные результаты интерпретируются совместно с культуральным исследованием, микроскопией и тестами на антигены, а также в рамках стандартизированных диагностических определений.