Diagnóstico Molecular: PCR e Sequenciamento

Os métodos moleculares detectam e identificam fungos pelos seus ácidos nucleicos, em vez de pelo crescimento ou aparência. A reação em cadeia da polimerase amplifica o DNA fúngico de amostras ou isolados, e o sequenciamento de regiões conservadas, especialmente o espaçador interno transcrito do aglomerado de genes ribossômicos, lê o DNA amplificado para nomear o organismo, muitas vezes de forma mais rápida e precisa do que a cultura.

Definition

Os diagnósticos moleculares para fungos são técnicas que amplificam e analisam ácidos nucleicos fúngicos, usando PCR para detectar DNA fúngico e sequenciamento de DNA de regiões conservadas, como o espaçador interno transcrito, para identificar o organismo ao nível de gênero ou espécie.

Scope

Este tópico abrange PCR espécie-específica e de amplo espectro (panfúngica), PCR em tempo real, sequenciamento de DNA de regiões de código de barras como o ITS, e o uso desses métodos em isolados de cultura e diretamente em material clínico, incluindo tecido fixado em formalina. Ele os enquadra como métodos de identificação e detecção e não oferece instruções de teste ou tratamento.

Core questions

• O DNA fúngico está presente nesta amostra, e de qual organismo ele provém?
• Quando a PCR panfúngica de amplo espectro é preferível a um ensaio espécie-específico?
• Qual região genômica melhor discrimina os fungos de interesse?
• Como os resultados moleculares são interpretados dados os riscos de contaminação e de detecção de DNA não viável?

Key concepts

• Reação em cadeia da polimerase (PCR)
• PCR espécie-específica versus de amplo espectro (panfúngica)
• PCR em tempo real (quantitativa)
• Espaçador interno transcrito (ITS) como um código de barras fúngico
• Sequenciamento de DNA e bancos de dados de referência
• Detecção em isolados versus diretamente em tecido
• Controle de contaminação e interpretação de DNA livre de células

Mechanisms

A PCR utiliza primers e uma polimerase termoestável para amplificar o DNA alvo através de ciclos repetidos, gerando cópias suficientes para detectar mesmo pequenas quantidades de material genético fúngico. Ensaios espécie-específicos visam um organismo conhecido, enquanto ensaios de amplo espectro ou panfúngicos usam primers contra regiões conservadas compartilhadas por muitos fungos, após o que o sequenciamento revela a identidade. A região do espaçador interno transcrito do aglomerado de genes de RNA ribossômico, flanqueada por primers conservados descritos por White e colegas, é suficientemente variável entre as espécies para atuar como um código de barras fúngico universal, e a sequência lida é comparada com bancos de dados de referência para nomear o organismo. A PCR em tempo real adiciona quantificação e velocidade, e os ensaios podem ser realizados em isolados cultivados ou diretamente em amostras clínicas, incluindo tecido fixado em formalina, embora o DNA degradado e a contaminação ambiental compliquem a interpretação. Como a PCR detecta DNA em vez de células viáveis, os resultados são lidos em conjunto com a cultura, microscopia e achados de antígenos.

Clinical relevance

A detecção molecular e o sequenciamento sustentam cada vez mais a forma como os fungos são identificados e como algumas infecções são reconhecidas, e certos resultados de PCR contribuem para categorias de consenso de doença fúngica invasiva provável. Esta entrada descreve os métodos e suas ressalvas interpretativas como material de referência e não direciona testes ou cuidados ao paciente.

Evidence & guidelines

As definições de consenso da EORTC/MSGERC incorporam resultados específicos de PCR entre os critérios micológicos para doença fúngica invasiva provável, refletindo o amadurecimento dos métodos moleculares, enquanto as recomendações de melhores práticas descrevem seu lugar ao lado da cultura e dos testes de antígenos. A abordagem de sequenciamento do ITS remonta aos primers amplamente utilizados publicados por White e colegas.

History

Após o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase na década de 1980, sua aplicação a fungos avançou rapidamente quando White e colegas publicaram, em 1990, primers para amplificar e sequenciar diretamente genes de RNA ribossômico fúngico, estabelecendo a região ITS como um marcador filogenético e, posteriormente, diagnóstico. A PCR em tempo real, os ensaios panfúngicos de amplo espectro e o sequenciamento de alto rendimento estenderam subsequentemente a micologia molecular da pesquisa para a identificação e detecção de rotina.

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

O que é a região ITS e por que ela é usada para identificar fungos?

O espaçador interno transcrito (ITS) é uma parte do aglomerado de genes ribossômicos fúngicos que varia o suficiente entre as espécies, enquanto é flanqueado por sequências conservadas, tornando-o um código de barras universal prático para a identificação fúngica baseada em sequenciamento.

Um PCR fúngico positivo prova infecção ativa?

Não por si só. A PCR detecta DNA fúngico, que pode persistir depois que os organismos não são mais viáveis ou surgir de contaminação, portanto, os resultados moleculares são interpretados juntamente com a cultura, microscopia e testes de antígenos e dentro de definições diagnósticas padronizadas.