Diagnóstico Molecular: PCR, RT-PCR e Amplificação de Ácidos Nucleicos

O diagnóstico molecular deteta um vírus amplificando e identificando o seu ácido nucleico. A reação em cadeia da polimerase (PCR) e, para vírus de RNA, a PCR de transcrição reversa (RT-PCR) copiam uma sequência genómica alvo milhões de vezes, de modo que mesmo quantidades muito pequenas de genoma viral se tornam detetáveis, conferindo a estes métodos alta sensibilidade e especificidade e tornando-os a base do diagnóstico viral moderno.

Definition

O diagnóstico molecular é a deteção e, quando necessário, a quantificação do ácido nucleico viral por técnicas de amplificação, como PCR, RT-PCR e métodos isotérmicos, que copiam um alvo genómico específico para níveis detetáveis.

Scope

Este tópico abrange as técnicas de amplificação de ácidos nucleicos utilizadas em virologia: PCR convencional e em tempo real, PCR de transcrição reversa para vírus de RNA, medição quantitativa da carga viral e alternativas isotérmicas, como a amplificação mediada por alça (LAMP). Explica os princípios e a interpretação a um nível de referência e não fornece protocolos de ensaio ou conselhos de gestão clínica.

Core questions

• Como a amplificação de uma sequência alvo torna um vírus detetável a partir de uma pequena quantidade inicial?
• Que etapa adicional um vírus de RNA requer em comparação com um vírus de DNA?
• Como a PCR em tempo real é usada para quantificar a carga viral e o que significa o limiar de ciclo?
• Quando os formatos isotérmicos ou multiplex são preferíveis à PCR convencional?

Key concepts

• Reação em cadeia da polimerase (PCR)
• Transcrição reversa (RT-PCR)
• Primers e especificidade do alvo
• Ciclo térmico e amplificação exponencial
• PCR em tempo real (quantitativa)
• Limiar de ciclo e carga viral
• Amplificação multiplex
• Amplificação isotérmica (por exemplo, LAMP)

Mechanisms

A PCR utiliza dois primers curtos que flanqueiam uma região escolhida do genoma viral, uma DNA polimerase termoestável e ciclos repetidos de aquecimento e arrefecimento. Cada ciclo desnatura o DNA, anela os primers e estende novas cadeias, duplicando o alvo de modo a que este se acumule exponencialmente. Para vírus de RNA, uma etapa de transcrição reversa converte primeiro o genoma de RNA em DNA complementar antes da amplificação. A PCR em tempo real monitoriza a acumulação do produto ciclo a ciclo usando repórteres fluorescentes, permitindo a quantificação: o limiar de ciclo no qual o sinal se eleva acima do fundo relaciona-se inversamente com a quantidade de molde inicial, fornecendo uma estimativa da carga viral. Desenhos multiplex amplificam vários alvos de uma só vez, e métodos isotérmicos, como a amplificação mediada por alça, alcançam a amplificação a uma temperatura constante, reduzindo os requisitos de instrumentação para testes descentralizados.

Clinical relevance

A amplificação de ácidos nucleicos proporciona uma deteção sensível e específica de infeção viral ativa e apoia a monitorização da carga viral utilizada para acompanhar infeções e a resposta ao tratamento. Esta entrada descreve como os métodos funcionam e como os resultados, como o limiar de ciclo, são interpretados em princípio, incluindo o ponto de que a deteção do genoma não prova por si só a presença de vírus infecioso; é descritiva da metodologia e não uma base para decisões individuais de diagnóstico ou tratamento.

Epidemiology

A RT-PCR em tempo real tornou-se o método de referência para confirmar a infeção por SARS-CoV-2, e a rápida publicação de ensaios validados no início de 2020 permitiu a expansão global dos testes moleculares, ilustrando como a amplificação de ácidos nucleicos sustenta a deteção e vigilância de surtos.

History

A reação em cadeia da polimerase foi concebida por Kary Mullis e aplicada pela primeira vez ao diagnóstico genético por Saiki e colegas em 1985, com o método formalizado por Mullis e Faloona em 1987. A PCR quantitativa em tempo real, descrita por Heid e colegas em 1996, adicionou quantificação contínua, e métodos isotérmicos como a amplificação mediada por alça, introduzida por Notomi e colegas em 2000, ampliaram os locais onde a amplificação poderia ser realizada.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

Qual é a diferença entre PCR e RT-PCR?

A PCR amplifica o DNA, sendo, portanto, usada diretamente para vírus de DNA. A RT-PCR adiciona uma etapa de transcrição reversa que converte primeiro o genoma de RNA de um vírus em DNA complementar, permitindo a deteção de vírus de RNA, como os da gripe e os coronavírus.

Um resultado positivo de PCR significa que o vírus infecioso está presente?

Não necessariamente. A PCR deteta o genoma viral, que pode persistir depois de um vírus já não estar a replicar ou ser infecioso. O estabelecimento da presença de vírus infecioso requer cultura ou outros ensaios funcionais interpretados no contexto clínico.