Sequenciamento de RNA e Transcriptômica

O sequenciamento de RNA (RNA-seq) determina a identidade e a abundância de moléculas de RNA em uma amostra por sequenciamento de alto rendimento, fornecendo uma imagem quantitativa e genômica da expressão gênica. A transcriptômica é o estudo desse conjunto completo de transcritos, o transcriptoma, e como ele muda entre tecidos, condições e estados de doença.

Definition

O sequenciamento de RNA é um método que converte RNA em uma biblioteca de fragmentos sequenciados e conta as leituras mapeadas para genes ou transcritos para quantificar a expressão em todo o transcriptoma, o conjunto completo de moléculas de RNA presentes em uma célula ou tecido.

Scope

Este tópico aborda como o RNA-seq transforma leituras de sequência em estimativas de expressão, o significado do transcriptoma como uma leitura dinâmica, unidades de quantificação comuns e as questões de qualidade e padronização específicas da medição baseada em sequenciamento. Ele trata o RNA-seq como uma plataforma de medição e descoberta, e não como um protocolo de teste clínico.

Core questions

• Como as leituras de sequenciamento são convertidas em estimativas quantitativas de expressão?
• O que o transcriptoma captura além de uma lista fixa de genes?
• Como a normalização e a profundidade de leitura afetam a comparabilidade?
• Como a precisão e a reprodutibilidade do RNA-seq são avaliadas?

Key concepts

• Transcriptoma
• Mapeamento e contagem de leituras
• Normalização (por exemplo, escalonamento de profundidade e comprimento)
• Expressão diferencial
• Controles de spike-in
• Transcriptômica de célula única e em massa

Mechanisms

O RNA é extraído, transcrito reversamente em cDNA, fragmentado e preparado em uma biblioteca de sequenciamento; as leituras resultantes são alinhadas a um genoma ou transcriptoma de referência, e o número de leituras que se sobrepõem a cada característica fornece uma contagem proporcional à sua expressão (Mortazavi et al., 2008). Como a profundidade total de leitura e o comprimento do transcrito influenciam as contagens brutas, os dados são normalizados antes que os transcritos possam ser comparados, e a abundância é frequentemente expressa em unidades escalonadas por comprimento e profundidade. O RNA-seq pode detectar novos transcritos, variantes de splicing e uma ampla faixa dinâmica de expressão, distinguindo-o do perfilamento anterior baseado em hibridização (Wang et al., 2009). Padrões externos de spike-in e benchmarking de consórcios são usados para caracterizar a precisão e os limites da plataforma (Jiang et al., 2011; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Clinical relevance

O RNA-seq está cada vez mais subjacente ao perfilamento molecular de tumores, detecção de fusões e classificação baseada em expressão, e a interpretação de tais dados requer a compreensão de como as contagens se tornam estimativas de expressão. Esta entrada descreve o método e suas propriedades quantitativas; ela não fornece interpretações diagnósticas ou orientação de tratamento, que se baseiam em ensaios validados e critérios clínicos.

Evidence & guidelines

Descrições fundamentais do RNA-seq como um método quantitativo (Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009) são complementadas por esforços da comunidade em precisão e reprodutibilidade, incluindo padrões externos de spike-in (Jiang et al., 2011) e o benchmarking SEQC/MAQC-III do desempenho do RNA-seq (2014).

History

A medição do transcriptoma passou de abordagens de etiquetas de sequência expressa e microarrays para o sequenciamento direto no final dos anos 2000, quando o sequenciamento de próxima geração tornou a contagem de leitura de todo o transcriptoma prática (Mortazavi et al., 2008). O RNA-seq rapidamente se tornou um padrão para estudos de expressão, e o trabalho subsequente do consórcio abordou como tornar suas medições comparáveis e reprodutíveis (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Debates

Como as contagens de RNA-seq devem ser normalizadas para comparação?

As contagens brutas dependem da profundidade de sequenciamento e do comprimento do transcrito, e diferentes escolhas de normalização podem mudar quais genes aparecem diferencialmente expressos; a seleção de normalização e controles apropriados continua sendo uma preocupação metodológica.

Key figures

• Zhong Wang
• Michael Snyder
• Ali Mortazavi
• Barbara Wold

Seminal works

• wang-2009
• mortazavi-2008
• seqc-2014

Frequently asked questions

O que é o transcriptoma?

O transcriptoma é o conjunto completo de transcritos de RNA presentes em uma célula ou tecido em um determinado momento; como ele muda com a condição e o tipo de célula, medi-lo mostra quais genes estão ativos e em que nível.

Como o RNA-seq difere dos microarrays para expressão?

O RNA-seq sequencia e conta o RNA diretamente, então ele pode detectar novos transcritos e variantes de splicing e cobre uma ampla faixa dinâmica, enquanto os microarrays medem a hibridização a sondas predefinidas e são limitados a sequências conhecidas.