Métodos de Sequenciamento de DNA e RNA

Os métodos de sequenciamento determinam a ordem precisa dos nucleotídeos no DNA ou, após conversão, no RNA. Desde a química de terminação de cadeia de Sanger até as plataformas de próxima geração massivamente paralelas, essas técnicas permitem que a patologia molecular leia genes base por base, detecte mutações e faça o perfil da expressão gênica em escala.

Definition

Os métodos de sequenciamento de DNA e RNA são técnicas laboratoriais que leem a ordem linear das bases nucleotídicas em uma molécula de ácido nucleico; o RNA é tipicamente transcrito reversamente para DNA complementar antes do sequenciamento.

Scope

O tópico abrange o sequenciamento de primeira geração (Sanger), o sequenciamento de próxima geração (massivamente paralelo) e o sequenciamento de RNA para análise do transcriptoma, juntamente com o fluxo de trabalho geral de preparação de biblioteca, sequenciamento e alinhamento de leituras. É apresentado como material de referência metodológica, e não como orientação para testes clínicos.

Key concepts

• Sequenciamento por terminação de cadeia (Sanger)
• Sequenciamento de próxima geração / massivamente paralelo
• Preparação de biblioteca
• Leituras de sequenciamento e cobertura
• Alinhamento de leituras e chamada de variantes
• Sequenciamento de RNA (transcriptômica)
• Sequenciamento direcionado, de exoma e de genoma completo

Mechanisms

O sequenciamento de Sanger incorpora dideoxinucleotídeos terminadores de cadeia para gerar fragmentos de todos os comprimentos, que são separados por tamanho para reconstruir a sequência (Sanger et al., 1977). O sequenciamento de próxima geração, por outro lado, prepara uma biblioteca de DNA fragmentado, amplifica-o espacialmente e sequencia milhões de fragmentos em paralelo, lendo trechos curtos cujos sinais são montados computacionalmente (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). O sequenciamento de RNA aplica a mesma abordagem paralela ao DNA complementar derivado do RNA, quantificando transcritos e revelando padrões de splicing e expressão (Wang et al., 2009). As leituras são alinhadas a uma referência para identificar variantes ou medir a abundância.

Clinical relevance

O sequenciamento apoia a detecção de variantes associadas a doenças e a caracterização molecular de tumores e patógenos. Esta entrada explica como os métodos geram dados de sequência e destina-se a ser uma referência; não aconselha sobre a seleção, interpretação ou ação em testes de sequenciamento no cuidado individual do paciente.

Evidence & guidelines

Os métodos baseiam-se em uma literatura primária fundamental, desde o método de terminação de cadeia de Sanger de 1977 até a primeira plataforma de picolitros de alto rendimento (Margulies et al., 2005) e a sequência do genoma humano (Venter et al., 2001), com revisões posteriores que examinam uma década de tecnologias de próxima geração e o surgimento do RNA-Seq (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

History

O método de terminação de cadeia de Sanger (1977) tornou o sequenciamento de DNA rotineiro e sustentou o primeiro sequenciamento do genoma humano (Venter et al., 2001). A introdução do sequenciamento massivamente paralelo em meados dos anos 2000 reduziu drasticamente o custo e aumentou o rendimento (Margulies et al., 2005), e em uma década o sequenciamento de próxima geração e o RNA-Seq tornaram-se ferramentas padrão para genômica e transcriptômica (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

Como o sequenciamento de próxima geração difere do sequenciamento de Sanger?

O sequenciamento de Sanger lê um fragmento de DNA por vez usando química de terminação de cadeia, enquanto o sequenciamento de próxima geração lê milhões de fragmentos simultaneamente de forma massivamente paralela, aumentando muito o rendimento e diminuindo o custo por base.

O RNA pode ser sequenciado diretamente?

O RNA é geralmente primeiro convertido em DNA complementar por transcrição reversa e depois sequenciado; essa abordagem de RNA-Seq quantifica transcritos e revela padrões de splicing e expressão.