PCR e Amplificação de Ácidos Nucleicos

A reação em cadeia da polimerase — um método cíclico, direcionado por primers, que copia exponencialmente um segmento de DNA escolhido — e a família mais ampla de técnicas de amplificação construídas sobre ela.

Definition

A reação em cadeia da polimerase é um método in vitro que amplifica uma região definida de DNA exponencialmente por ciclos repetidos de separação de fitas, anelamento de primers flanqueadores e extensão por uma DNA polimerase termoestável; a amplificação de ácidos nucleicos abrange mais amplamente técnicas relacionadas para copiar sequências de DNA ou RNA.

Scope

Este tópico abrange os princípios e variantes da amplificação de ácidos nucleicos: a ciclagem térmica de desnaturação, anelamento de primers e extensão que define a reação em cadeia da polimerase; o papel dos primers e da polimerase termoestável; e extensões como a transcrição reversa e a amplificação quantitativa em tempo real. Ele trata do método e sua lógica; o sequenciamento e a clonagem que utilizam DNA amplificado são abordados em tópicos complementares.

Core questions

• Como ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento amplificam uma região específica de DNA?
• Por que dois primers e uma polimerase termoestável são essenciais?
• Como a amplificação se torna exponencial?
• Como o método é estendido para quantificar ácidos nucleicos ou para amplificar RNA?

Key theories

Amplificação exponencial definida por primers

Um par de primers flanqueando o alvo define a região amplificada, e como cada nova fita serve como molde no próximo ciclo, o número de cópias do alvo duplica aproximadamente por ciclo, crescendo exponencialmente.

Polimerase termoestável permite a ciclagem

O uso de uma DNA polimerase termoestável permite a desnaturação repetida em alta temperatura sem a necessidade de adicionar novamente a enzima, tornando a ciclagem térmica automatizada prática e a reação robusta.

Mechanisms

Cada ciclo aquece a amostra para separar as fitas de DNA, resfria-a para que dois primers se anelem a sequências que flanqueiam o alvo em fitas opostas, e a aquece a uma temperatura de extensão na qual uma polimerase termoestável sintetiza novas fitas a partir dos primers. Como os produtos de um ciclo servem de molde para o próximo, a região alvo é amplificada exponencialmente ao longo de muitos ciclos. As variantes incluem a amplificação por transcrição reversa, que primeiro copia o RNA em DNA, e a amplificação quantitativa em tempo real, que monitora o acúmulo do produto para medir as quantidades iniciais.

Clinical relevance

A amplificação é central para testes genéticos, detecção de patógenos e identificação forense; apresentada como significado, e não como orientação clínica.

History

Mullis concebeu a reação em cadeia da polimerase no início dos anos 1980, e o relatório de 1985 de Saiki e colegas demonstrou seu uso, com a posterior adoção da polimerase termoestável tornando-a rotineira; a invenção foi reconhecida pelo Prêmio Nobel de Química de 1993.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

Por que a PCR precisa de primers?

Os primers definem os pontos de partida da síntese em cada fita, determinando assim qual região é copiada e permitindo que a polimerase inicie a extensão.

O que torna a amplificação exponencial?

As novas fitas de cada ciclo tornam-se moldes no ciclo seguinte, de modo que o número de cópias do alvo duplica aproximadamente a cada ciclo.