실시간 정량 분석 및 복제수 평가

정량적 분자 방법은 표적 핵산의 존재 여부뿐만 아니라 그 양을 측정합니다. 실시간 정량 PCR은 증폭이 일어나는 동안 이를 추적하고, 디지털 PCR은 샘플을 분할하여 분자 수를 절대적으로 계산하며, 복제수 평가는 유전체 영역의 획득 또는 손실 여부를 결정합니다.

Definition

실시간 정량 분석은 일반적으로 증폭 중 형광 신호를 모니터링하거나(실시간 PCR) 양성 분할을 계산하여(디지털 PCR) 표적 핵산의 양을 측정합니다. 복제수 평가는 참조 유전체 영역에 대한 특정 유전체 영역의 복제수(copy number)를 결정합니다.

Scope

이 주제는 실시간(정량) PCR, 디지털 및 액적 디지털 PCR, 그리고 복제수 평가 접근법을 다룹니다. 이는 정량화 원리와 결과의 비교 가능성을 위한 고려 사항을 임상 테스트 지침이 아닌 방법론적 참고 자료로 제시합니다.

Key concepts

• 실시간(정량) PCR
• 정량화 주기(Cq) 및 증폭 효율
• 표준 곡선 및 상대 정량화
• 디지털 및 액적 디지털 PCR
• 분할을 통한 절대 정량화
• 복제수 획득 및 손실
• 보고 표준 및 재현성

Mechanisms

실시간 PCR은 증폭과 형광 리포터를 결합하여 제품 축적에 비례하여 신호가 증가합니다. 신호가 임계값을 넘는 주기는 초기 표적 양을 반영하여 상대적 또는 표준 곡선 정량화를 가능하게 합니다(Heid et al., 1996). 반면 디지털 PCR은 샘플을 많은 작은 분할로 나누어 각 분할에 0개 또는 소수의 분자가 포함되도록 합니다. 양성 분할의 비율을 세고 푸아송 통계를 적용하면 표준 곡선 없이 절대적인 수를 얻을 수 있습니다(Hindson et al., 2011). 복제수 평가는 증폭 또는 결실을 감지하기 위해 표적 영역의 풍부도를 참조와 비교하며, 이는 비교 유전체 혼성화(comparative genomic hybridization)에 의해 개척된 아이디어입니다(Kallioniemi et al., 1992).

Clinical relevance

정량 및 복제수 방법은 병원체 부하, 유전자 발현, 유전체 획득 또는 손실을 측정하는 데 사용됩니다. 이 항목은 정량화가 어떻게 작동하는지에 대한 방법론적 참고 자료를 설명하며, 환자 치료에서 특정 정량 분석법을 선택, 해석 또는 조치하는 것에 대해 조언하지 않습니다.

Evidence & guidelines

정량 PCR 보고는 재현 가능한 출판에 필요한 최소 정보를 명시하는 MIQE 권고 사항에 따라 이루어집니다(Bustin et al., 2009). 기초적인 주요 연구들은 실시간 정량화(Heid et al., 1996), 절대 디지털 정량화(Hindson et al., 2011), 그리고 유전체 전반의 복제수 측정(Kallioniemi et al., 1992)을 기술하고 있습니다.

History

1990년대 중반의 실시간 PCR은 증폭을 정성적 도구에서 정량적 도구로 전환시켰고(Heid et al., 1996), 10년 후 합의된 보고 표준이 뒤따랐습니다(Bustin et al., 2009). 디지털 PCR, 특히 액적 디지털 PCR은 높은 정밀도로 분자를 절대적으로 계수할 수 있게 했으며(Hindson et al., 2011), 복제수 평가는 비교 유전체 혼성화에서 어레이 및 시퀀싱 기반 방법으로 발전했습니다(Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

디지털 PCR은 실시간 정량 PCR과 어떻게 다른가요?

실시간 PCR은 형광 신호가 임계값을 넘는 시점으로부터 표적의 초기 양을 추정하며, 일반적으로 표준에 상대적입니다. 반면 디지털 PCR은 샘플을 분할하고 양성 구획을 세어 표준 곡선 없이 절대적인 분자 수를 제공합니다.

복제수 평가는 무엇을 측정하나요?

이는 특정 유전체 영역이 참조에 비해 몇 개의 복제수를 가지고 있는지를 결정하여 해당 영역의 증폭(획득) 또는 결실(손실)을 식별합니다.