실시간 PCR 및 정량 PCR 적용

정량 PCR(qPCR)이라고도 불리는 실시간 PCR은 형광 신호를 통해 증폭된 DNA의 축적량을 주기별로 측정하여 표적 서열의 초기량을 추정할 수 있게 합니다. 역전사(RT-qPCR)와 결합하여 분자 병리학에서 유전자 발현을 정량화하는 데 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다.

Definition

실시간 정량 PCR은 형광을 통해 실시간으로 생성물 형성을 모니터링하고, 정량 주기를 사용하여 DNA 또는 (역전사 후) RNA 표적의 초기량을 추정하는 핵산 증폭 방법입니다.

Scope

이 주제는 실시간 PCR의 측정 원리, 정량 주기(Cq)와 주형량과의 관계, 비교 2-DDCT 방법을 이용한 상대 정량, 참조 유전자 및 증폭 효율의 역할, 그리고 재현성을 규정하는 보고 표준을 다룹니다. 또한 관련 절대 정량 접근법으로 디지털 PCR에 대해서도 언급합니다. 이는 임상 테스트 프로토콜이 아닌 실험실 방법으로 다루어집니다.

Core questions

• 정량 주기는 초기 주형량과 어떻게 관련됩니까?
• RT-qPCR에서 상대 발현은 어떻게 계산되고 정규화됩니까?
• 증폭 효율과 참조 유전자 선택이 결과에 왜 영향을 미칩니까?
• 디지털 PCR은 정량을 달성하는 데 실시간 PCR과 어떻게 다릅니까?

Key concepts

• 정량 주기 (Cq / Ct)
• 증폭 효율
• 비교 2-DDCT 방법
• 참조 (하우스키핑) 유전자
• 역전사 qPCR
• 디지털 PCR 및 분할
• MIQE 보고 표준

Mechanisms

PCR 동안 표적 서열은 지수 성장 단계에서 매 주기마다 두 배로 증가하며, 형광 리포터(삽입 염료 또는 서열 특이적 프로브)는 축적된 생성물에 비례하는 신호를 방출합니다. 형광이 정의된 역치(정량 주기, Cq 또는 Ct)를 넘는 주기는 초기 주형량의 로그에 반비례하므로, Cq 값이 낮을수록 표적이 많다는 것을 의미합니다. 상대 발현은 일반적으로 비교 2-DDCT 방법으로 계산되며, 이는 표적의 Cq를 참조 유전자 및 교정기 샘플에 대해 정규화하며, 거의 동일한 증폭 효율을 가정합니다(Livak & Schmittgen, 2001). 효율성, 참조 유전자 안정성 및 역전사 가변성이 모두 추정치에 영향을 미치므로, MIQE 가이드라인은 결과 해석에 필요한 실험 세부 사항 및 검증을 명시합니다(Bustin et al., 2009). 디지털 PCR은 대신 샘플을 많은 반응으로 분할하고 양성 분할을 계산하여 표준 곡선 없이 절대 정량을 제공합니다(Huggett et al., 2013).

Clinical relevance

RT-qPCR은 분자 진단 및 예후 판독의 기반이 되는 전사체 수준을 측정하는 일상적인 플랫폼이며, 그 가정을 이해하는 것은 실험실 보고서를 해석하는 데 필수적입니다. 이 항목은 방법과 그 한계를 설명하며, 검증된 분석법에 의존하는 진단 기준점이나 환자 관리의 근거가 아닙니다.

Evidence & guidelines

실시간 PCR에 대한 보고 및 품질 기대치는 MIQE 가이드라인(Bustin et al., 2009)에, 디지털 PCR에 대해서는 디지털 MIQE 가이드라인(Huggett et al., 2013)에 명시되어 있습니다. 비교 2-DDCT 방법(Livak & Schmittgen, 2001)은 상대 정량에 대한 표준 참조로 남아 있습니다.

History

실시간 PCR은 1990년대에 형광 검출이 열 순환과 결합되면서 등장하여, 노동 집약적인 종점 정량법을 대체했습니다. 비교 2-DDCT 방법(2001)은 상대 정량을 표준화했고, MIQE 가이드라인(2009)은 광범위한 재현성 문제를 해결했으며, 디지털 PCR은 이후 절대 정량 방향으로 분야를 확장했습니다.

Debates

정규화를 위한 참조 유전자는 어떻게 선택해야 합니까?

상대 정량은 조건 전반에 걸쳐 안정적인 참조 유전자 발현을 가정하지만, 단일 하우스키핑 유전자는 변동될 수 있습니다. 편향된 정규화를 피하기 위해 검증된 다중 참조 유전자를 사용하는 것이 권장됩니다.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

Ct 값이 낮다는 것은 무엇을 의미합니까?

정량 주기(Ct 또는 Cq) 값이 낮다는 것은 형광이 역치를 더 일찍 넘는다는 것을 의미하며, 이는 더 많은 초기 표적 주형이 있음을 나타냅니다. Ct는 초기량의 로그에 반비례합니다.

디지털 PCR은 실시간 qPCR과 어떻게 다릅니까?

디지털 PCR은 반응을 많은 작은 구획으로 분할하고 표적을 포함하는 구획의 수를 세어 표준 곡선 없이 절대적인 수를 제공하는 반면, 실시간 qPCR은 정량 주기에서 양을 추론하며, 일반적으로 상대적인 측정값입니다.