کاربردهای PCR همزمان و PCR کمی
PCR همزمان، که PCR کمی (qPCR) نیز نامیده میشود، تجمع DNA تکثیر شده را چرخه به چرخه از طریق یک سیگنال فلورسنت اندازهگیری میکند و امکان تخمین مقدار اولیه یک توالی هدف را فراهم میآورد. این روش، در ترکیب با رونویسی معکوس (RT-qPCR)، یکی از پرکاربردترین روشها برای کمیسازی بیان ژن در آسیبشناسی مولکولی است.
Definition
PCR کمی همزمان یک روش تکثیر اسید نوکلئیک است که تشکیل محصول را به صورت همزمان از طریق فلورسانس نظارت میکند و از چرخه کمیسازی برای تخمین مقدار اولیه یک هدف DNA یا (پس از رونویسی معکوس) RNA استفاده میکند.
Scope
این موضوع شامل اصول اندازهگیری PCR همزمان، چرخه کمیسازی (Cq) و ارتباط آن با مقدار الگو، کمیسازی نسبی با روش مقایسهای 2-DDCT، نقش ژنهای مرجع و کارایی تکثیر، و استانداردهای گزارشدهی که حاکم بر قابلیت تکرارپذیری هستند، میشود. همچنین PCR دیجیتال را به عنوان یک رویکرد کمیسازی مطلق مرتبط مورد توجه قرار میدهد. این موارد به عنوان روشهای آزمایشگاهی، و نه پروتکلهای آزمایش بالینی، بررسی میشوند.
Core questions
- چرخه کمیسازی چگونه با مقدار الگوی اولیه ارتباط دارد؟
- بیان نسبی در RT-qPCR چگونه محاسبه و نرمالیزه میشود؟
- چرا کارایی تکثیر و انتخاب ژن مرجع بر نتیجه تأثیر میگذارد؟
- PCR دیجیتال در دستیابی به کمیسازی چه تفاوتی با PCR همزمان دارد؟
Key concepts
- چرخه کمیسازی (Cq / Ct)
- کارایی تکثیر
- روش مقایسهای 2-DDCT
- ژنهای مرجع (خانهدار)
- RT-qPCR (رونویسی معکوس PCR کمی)
- PCR دیجیتال و تقسیمبندی
- استانداردهای گزارشدهی MIQE
Mechanisms
در طول PCR، توالی هدف در فاز لگاریتمی در هر چرخه دو برابر میشود و یک گزارشگر فلورسنت (یک رنگ بینابینی یا یک پروب اختصاصی توالی) سیگنالی متناسب با محصول انباشته شده ساطع میکند. چرخهای که در آن فلورسانس از یک آستانه تعریف شده عبور میکند (چرخه کمیسازی، Cq یا Ct) با لگاریتم مقدار اولیه الگو رابطه معکوس دارد، بنابراین Cq کمتر به معنای هدف بیشتر است. بیان نسبی معمولاً با روش مقایسهای 2-DDCT محاسبه میشود، که Cq هدف را با یک ژن مرجع و یک نمونه کالیبراتور نرمالیزه میکند، با فرض کاراییهای تکثیر تقریباً برابر (Livak & Schmittgen, 2001). از آنجا که کارایی، پایداری ژن مرجع، و تغییرپذیری رونویسی معکوس همگی بر تخمین تأثیر میگذارند، دستورالعملهای MIQE جزئیات تجربی و اعتبارسنجی لازم برای قابل تفسیر بودن یک نتیجه را مشخص میکنند (Bustin et al., 2009). PCR دیجیتال به جای آن، نمونه را به واکنشهای متعدد تقسیم میکند و بخشهای مثبت را میشمارد، که کمیسازی مطلق را بدون منحنی استاندارد فراهم میکند (Huggett et al., 2013).
Clinical relevance
RT-qPCR یک پلتفرم روتین برای اندازهگیری سطوح رونویسی در پشت نتایج تشخیصی و پیشآگهی مولکولی است، و درک مفروضات آن بخشی از تفسیر گزارشهای آزمایشگاهی است. این مدخل روش و محدودیتهای آن را توضیح میدهد و مبنایی برای نقاط برش تشخیصی یا مدیریت بیمار نیست، که به آزمایشهای معتبر بستگی دارد.
Evidence & guidelines
انتظارات گزارشدهی و کیفیت برای PCR همزمان در دستورالعملهای MIQE (Bustin et al., 2009) و برای PCR دیجیتال، در دستورالعملهای MIQE دیجیتال (Huggett et al., 2013) بیان شده است. روش مقایسهای 2-DDCT (Livak & Schmittgen, 2001) همچنان مرجع استاندارد برای کمیسازی نسبی است.
History
PCR همزمان در دهه ۱۹۹۰ زمانی پدیدار شد که تشخیص فلورسنت با چرخه حرارتی ترکیب شد و جایگزین کمیسازی نقطه پایانی پرزحمت شد. روش مقایسهای 2-DDCT (۲۰۰۱) کمیسازی نسبی را استاندارد کرد، دستورالعملهای MIQE (۲۰۰۹) مشکلات گسترده تکرارپذیری را برطرف کرد، و PCR دیجیتال بعدها این حوزه را به سمت کمیسازی مطلق گسترش داد.
Debates
- ژنهای مرجع برای نرمالیزاسیون چگونه باید انتخاب شوند؟
- کمیسازی نسبی فرض میکند که بیان ژن مرجع در شرایط مختلف پایدار است، اما ژنهای خانهدار منفرد میتوانند متغیر باشند؛ استفاده از ژنهای مرجع متعدد و معتبر برای جلوگیری از نرمالیزاسیون مغرضانه توصیه میشود.
Key figures
- Stephen Bustin
- Kenneth Livak
- Thomas Schmittgen
- Jim Huggett
Related topics
Seminal works
- livak-2001
- bustin-2009
- huggett-2013
Frequently asked questions
- مقدار Ct پایینتر به چه معناست؟
- چرخه کمیسازی (Ct یا Cq) پایینتر به این معنی است که فلورسانس زودتر از آستانه عبور میکند، که نشاندهنده وجود الگوی هدف اولیه بیشتر است؛ Ct با لگاریتم مقدار اولیه رابطه معکوس دارد.
- PCR دیجیتال چه تفاوتی با qPCR همزمان دارد؟
- PCR دیجیتال واکنش را به بسیاری از بخشهای کوچک تقسیم میکند و تعداد بخشهایی که حاوی هدف هستند را میشمارد، که یک شمارش مطلق بدون منحنی استاندارد ارائه میدهد، در حالی که qPCR همزمان مقدار را از چرخه کمیسازی استنباط میکند، معمولاً به عنوان یک معیار نسبی.