تجزیه و تحلیل کمی بیان ژن
تجزیه و تحلیل کمی بیان ژن مجموعهای از روشهای مولکولی است که برای اندازهگیری میزان بیان یک ژن در یک بافت یا جمعیت سلولی، با کمیسازی رونویسهای RNA پیامرسان یا محصولات پروتئینی آنها، استفاده میشود. در آسیبشناسی مولکولی، این روش شواهد عددی را فراهم میکند که فعالیت مولکولی یک نمونه را به تشخیص، طبقهبندی و پیشآگهی مرتبط میسازد.
Definition
تجزیه و تحلیل کمی بیان ژن، اندازهگیری فراوانی محصولات ژنی (رونویسهای RNA یا پروتئینها) در یک نمونه بیولوژیکی است که در مقیاس نسبی یا مطلق بیان میشود تا وضعیت مولکولی سلولها یا بافتها را مشخص کند.
Scope
این حوزه خواننده را با پلتفرمهای کمی اصلی مورد استفاده در آسیبشناسی و پزشکی آزمایشگاهی آشنا میکند: PCR کمی و بلادرنگ، توالییابی RNA و ترانسکریپتومیکس، ایمونوهیستوشیمی و سایر روشهای تشخیص پروتئین، امضاهای بیان ژنی پیشآگهیدهنده که از این اندازهگیریها به دست میآیند، و روشهای تضمین کیفیت که اعداد را قابل اعتماد میسازند. این موارد به عنوان روشهای اندازهگیری و نه دستورالعملهای بالینی مطرح میشوند.
Sub-topics
Core questions
- فراوانی یک رونویس یا پروتئین چگونه اندازهگیری و نرمالسازی میشود؟
- چه زمانی اندازهگیری نسبی کافی است و چه زمانی کمیسازی مطلق مورد نیاز است؟
- اندازهگیریهای بیان چگونه به طبقهبندی تشخیصی یا پیشآگهیدهنده ترجمه میشوند؟
- چه کنترلها و استانداردهایی یک نتیجه کمی را در آزمایشگاههای مختلف قابل تکرار میسازند؟
Key concepts
- فراوانی رونویس و فراوانی پروتئین
- کمیسازی نسبی در مقابل مطلق
- نرمالسازی و ژنهای مرجع
- امضاهای بیان ژن
- اعتبار تحلیلی و قابلیت تکرار
- فازهای پیشتحلیلی، تحلیلی و پستحلیلی
Mechanisms
همه روشهای بیان کمی، یک کمیت مولکولی را به یک سیگنال قابل اندازهگیری تبدیل میکنند که با مقدار هدف مقیاسبندی میشود. PCR کمی رونویسی معکوس، cDNA را تکثیر میکند و چرخهای را که در آن فلورسانس از یک آستانه عبور میکند، میخواند، با کمیسازی نسبی که معمولاً با رویکرد مقایسهای 2-DDCT گزارش میشود (Livak & Schmittgen, 2001). توالییابی RNA، خوانشهای نگاشت شده به رونویسها را شمارش میکند و عمق توالی را به تخمینهای بیان تبدیل میکند (Wang et al., 2009). ایمونوهیستوشیمی پروتئین را با آنتیبادیهای نشاندار تشخیص میدهد و شدت و وسعت رنگآمیزی را گزارش میکند. در سراسر پلتفرمها، سیگنال خام باید با استانداردهای مرجع نرمالسازی شود تا تفاوتهای بیولوژیکی از تغییرات فنی جدا شوند، الزامی که برای qPCR توسط دستورالعملهای MIQE رسمی شده است (Bustin et al., 2009).
Clinical relevance
اندازهگیریهای بیان کمی زیربنای طبقهبندی مولکولی تومور، گزارشدهی نشانگرهای زیستی، و آزمایشهای پیشآگهیدهنده چندژنی هستند، و خواندن انتقادی آنها بخشی از عملکرد پزشکی آزمایشگاهی است. این مدخل چگونگی تولید و تفسیر این اندازهگیریها را به عنوان یک حوزه روش توصیف میکند؛ این منبعی برای آستانههای تشخیصی یا تصمیمات درمانی نیست، که به آزمایشهای معتبر و دستورالعملهای بالینی تعلق دارند.
Evidence & guidelines
ادبیات روششناختی شامل استانداردهای گزارشدهی مانند دستورالعملهای MIQE برای qPCR (Bustin et al., 2009)، توصیفات بنیادی RNA-seq به عنوان یک پلتفرم کمی (Wang et al., 2009; Mortazavi et al., 2008)، و نمایشهای برجسته مبنی بر اینکه پروفایلهای بیان حاوی اطلاعات پیشآگهیدهنده هستند (van 't Veer et al., 2002) میشود. این موارد در کنار هم هم تکنیکها و هم استانداردهایی را که نتایج آنها بر اساس آنها قضاوت میشوند، تعریف میکنند.
History
تجزیه و تحلیل بیان کمی از بلاتهای نورترن با توان عملیاتی پایین و RT-PCR اولیه به سمت PCR بلادرنگ در دهه 1990، پروفایلینگ مبتنی بر میکروآرایه در حدود سال 2000، و توالییابی RNA با توان عملیاتی بالا از اواخر دهه 2000 رشد کرد. مطالعه پروفایلینگ سرطان پستان در سال 2002 (van 't Veer et al.) نشان داد که الگوهای بیان میتوانند پیامد را پیشبینی کنند، و دستورالعملهای MIQE در سال 2009 نشاندهنده تغییری به سمت کمیسازی استاندارد و قابل تکرار بود.
Key figures
- Stephen Bustin
- Kenneth Livak
- Laura van 't Veer
Related topics
Seminal works
- bustin-2009
- wang-2009
- vantveer-2002
- livak-2001
Frequently asked questions
- تفاوت بین کمیسازی نسبی و مطلق چیست؟
- کمیسازی نسبی بیان یک هدف را با یک مرجع مقایسه میکند (به عنوان مثال، روش مقایسهای 2-DDCT در qPCR)، در حالی که کمیسازی مطلق یک عدد کپی واقعی یا غلظت را در برابر یک استاندارد کالیبره شده گزارش میدهد. بیشتر مطالعات بیان از اندازهگیریهای نسبی استفاده میکنند؛ اندازهگیریهای مطلق نیاز به کالیبراسیون اضافی دارند.
- چرا نرمالسازی در تجزیه و تحلیل بیان ضروری است؟
- سیگنال خام هم بیان بیولوژیکی و هم عوامل فنی مانند مقدار ورودی، کارایی و عمق توالییابی را منعکس میکند؛ نرمالسازی به ژنهای مرجع یا استانداردها جزء فنی را حذف میکند تا تفاوتهای اندازهگیری شده منعکسکننده زیستشناسی واقعی باشند.