تشخیصهای مولکولی: PCR و تعیین توالی
روشهای مولکولی قارچها را بر اساس اسیدهای نوکلئیک آنها شناسایی میکنند، نه بر اساس رشد یا ظاهرشان. واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) DNA قارچی را از نمونهها یا ایزولهها تکثیر میکند و تعیین توالی نواحی حفاظتشده، بهویژه ناحیه فاصلهگذار رونویسیشده داخلی (ITS) از خوشه ژنی ریبوزومی، DNA تکثیرشده را برای نامگذاری ارگانیسم میخواند که اغلب سریعتر و دقیقتر از کشت است.
Definition
تشخیصهای مولکولی برای قارچها، تکنیکهایی هستند که اسیدهای نوکلئیک قارچی را تکثیر و تحلیل میکنند، با استفاده از PCR برای تشخیص DNA قارچی و تعیین توالی DNA نواحی حفاظتشده مانند ناحیه فاصلهگذار رونویسیشده داخلی برای شناسایی ارگانیسم تا سطح جنس یا گونه.
Scope
این موضوع شامل PCR گونهخاص و وسیعالطیف (پانقارچی)، PCR بلادرنگ، تعیین توالی DNA نواحی بارکدینگ مانند ITS، و استفاده از این روشها بر روی ایزولههای کشتشده و مستقیماً بر روی مواد بالینی، از جمله بافتهای تثبیتشده با فرمالین است. این روشها را به عنوان روشهای شناسایی و تشخیص معرفی میکند و هیچ دستورالعمل آزمایش یا درمانی ارائه نمیدهد.
Core questions
- آیا DNA قارچی در این نمونه وجود دارد و از کدام ارگانیسم منشأ میگیرد؟
- چه زمانی PCR پانقارچی وسیعالطیف بر آزمایش گونهخاص ترجیح داده میشود؟
- کدام ناحیه ژنومی بهترین تمایز را بین قارچهای مورد نظر ایجاد میکند؟
- نتایج مولکولی با توجه به خطرات آلودگی و تشخیص DNA غیرزنده چگونه تفسیر میشوند؟
Key concepts
- واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)
- PCR گونهخاص در مقابل وسیعالطیف (پانقارچی)
- PCR بلادرنگ (کمی)
- ناحیه فاصلهگذار رونویسیشده داخلی (ITS) به عنوان بارکد قارچی
- تعیین توالی DNA و پایگاههای داده مرجع
- تشخیص بر روی ایزولهها در مقابل مستقیم بر روی بافت
- کنترل آلودگی و تفسیر DNA بدون سلول
Mechanisms
PCR از پرایمرها و یک پلیمراز مقاوم به حرارت برای تکثیر DNA هدف از طریق چرخههای مکرر استفاده میکند و به اندازهای کپی تولید میکند که حتی مقادیر کمی از مواد ژنتیکی قارچی را نیز تشخیص دهد. آزمایشهای گونهخاص یک ارگانیسم شناختهشده را هدف قرار میدهند، در حالی که آزمایشهای وسیعالطیف یا پانقارچی از پرایمرهایی علیه نواحی حفاظتشده مشترک بین بسیاری از قارچها استفاده میکنند، که پس از آن تعیین توالی هویت را آشکار میکند. ناحیه فاصلهگذار رونویسیشده داخلی از خوشه ژن rRNA، که توسط پرایمرهای حفاظتشده توصیفشده توسط وایت و همکارانش احاطه شده است، به اندازه کافی بین گونهها متغیر است تا به عنوان یک بارکد جهانی قارچی عمل کند، و توالی خواندهشده با پایگاههای داده مرجع مطابقت داده میشود تا ارگانیسم نامگذاری شود. PCR بلادرنگ، قابلیت کمیسازی و سرعت را اضافه میکند، و آزمایشها را میتوان بر روی ایزولههای کشتشده یا مستقیماً بر روی نمونههای بالینی، از جمله بافتهای تثبیتشده با فرمالین، انجام داد، اگرچه DNA تخریبشده و آلودگی محیطی تفسیر را پیچیده میکنند. از آنجا که PCR DNA را تشخیص میدهد نه سلولهای زنده، نتایج همراه با کشت، میکروسکوپی و یافتههای آنتیژن تفسیر میشوند.
Clinical relevance
تشخیص و تعیین توالی مولکولی به طور فزایندهای اساس شناسایی قارچها و تشخیص برخی عفونتها را تشکیل میدهد، و نتایج خاص PCR به دستهبندیهای اجماعی بیماری قارچی مهاجم احتمالی کمک میکند. این مدخل روشها و ملاحظات تفسیری آنها را به عنوان یک منبع مرجع توصیف میکند و دستورالعمل آزمایش یا مراقبت از بیمار را ارائه نمیدهد.
Evidence & guidelines
تعاریف اجماعی از EORTC/MSGERC نتایج مشخص PCR را در میان معیارهای قارچشناسی برای بیماری قارچی مهاجم احتمالی گنجاندهاند، که نشاندهنده بلوغ روشهای مولکولی است، در حالی که توصیههای بهترین عملکرد، جایگاه آنها را در کنار کشت و آزمایش آنتیژن توصیف میکنند. رویکرد تعیین توالی ITS به پرایمرهای پرکاربرد منتشرشده توسط وایت و همکارانش بازمیگردد.
History
پس از توسعه واکنش زنجیرهای پلیمراز در دهه ۱۹۸۰، کاربرد آن در قارچها به سرعت پیشرفت کرد، زمانی که وایت و همکارانش در سال ۱۹۹۰ پرایمرهایی را برای تکثیر و تعیین توالی مستقیم ژنهای rRNA قارچی منتشر کردند و ناحیه ITS را به عنوان یک نشانگر فیلوژنتیک و سپس تشخیصی معرفی کردند. PCR بلادرنگ، آزمایشهای پانقارچی وسیعالطیف، و تعیین توالی با توان بالا متعاقباً قارچشناسی مولکولی را از تحقیقات به شناسایی و تشخیص روتین گسترش دادند.
Related topics
Seminal works
- white-1990
- donnelly-2020
Frequently asked questions
- ناحیه ITS چیست و چرا برای شناسایی قارچها استفاده میشود؟
- ناحیه فاصلهگذار رونویسیشده داخلی (ITS) بخشی از خوشه ژنی ریبوزومی قارچ است که به اندازه کافی بین گونهها متغیر است، در حالی که توسط توالیهای حفاظتشده احاطه شده است، که آن را به یک بارکد جهانی عملی برای شناسایی قارچی مبتنی بر تعیین توالی تبدیل میکند.
- آیا PCR مثبت قارچی عفونت فعال را اثبات میکند؟
- به تنهایی خیر. PCR DNA قارچی را تشخیص میدهد که میتواند پس از عدم حیات ارگانیسمها باقی بماند یا از آلودگی ناشی شود، بنابراین نتایج مولکولی همراه با کشت، میکروسکوپی و آزمایشهای آنتیژن و در چارچوب تعاریف تشخیصی استاندارد تفسیر میشوند.