PCR و تکنیک‌های تکثیر اسید نوکلئیک

تکنیک‌های تکثیر اسید نوکلئیک، یک توالی DNA یا RNA انتخاب شده را بارها تکثیر می‌کنند تا یک هدف که به مقدار ناچیز وجود دارد، قابل تشخیص و اندازه‌گیری شود. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) نمونه اولیه این تکنیک‌ها است: از طریق چرخه‌های مکرر واسرشت‌سازی، اتصال آغازگر و بسط پلیمراز، افزایش نمایی در یک توالی تعریف شده ایجاد می‌کند و آن را به سنگ بنای تشخیص‌های مولکولی تبدیل می‌کند.

Definition

تکنیک‌های تکثیر اسید نوکلئیک، روش‌های آزمایشگاهی (in vitro) هستند که به صورت آنزیمی نسخه‌های زیادی از یک توالی DNA یا RNA خاص تولید می‌کنند، در حالی که PCR از چرخه‌زنی حرارتی و یک DNA پلیمراز برای تکثیر ناحیه‌ای که توسط دو آغازگر تعریف شده است، استفاده می‌کند.

Scope

این موضوع شامل PCR نقطه پایانی متداول، PCR بلادرنگ (کمی)، PCR رونویسی معکوس برای اهداف RNA، و جایگزین‌های هم‌دما مانند تکثیر هم‌دمای با واسطه حلقه می‌شود. این مبحث به اصول، اجزا و ملاحظات گزارش‌دهی تکثیر به عنوان یک مرجع روش‌شناختی می‌پردازد، نه به عنوان پروتکل‌های آزمایشگاهی یا راهنمای بالینی.

Key concepts

• چرخه‌زنی حرارتی (واسرشت‌سازی، اتصال، بسط)
• آغازگرها و DNA پلیمراز
• تکثیر نمایی
• PCR رونویسی معکوس برای اهداف RNA
• PCR بلادرنگ (کمی)
• تکثیر هم‌دما (مثلاً LAMP)
• کنترل آلودگی و نتایج مثبت کاذب

Mechanisms

در PCR، DNA دو رشته‌ای با حرارت به رشته‌های تک‌رشته‌ای واسرشت می‌شود، آغازگرهای الیگونوکلئوتیدی کوتاه به توالی‌های مجاور هدف متصل می‌شوند، و یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت، آغازگرها را بسط می‌دهد تا رشته‌های مکمل جدیدی سنتز کند؛ تکرار چرخه، هدف را در هر دور دو برابر می‌کند و منجر به تکثیر نمایی می‌شود (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). اهداف RNA قبل از تکثیر ابتدا توسط ترانس‌کریپتاز معکوس به DNA مکمل تبدیل می‌شوند. PCR بلادرنگ، تجمع محصول را چرخه به چرخه با استفاده از گزارشگرهای فلورسنت نظارت می‌کند و امکان کمی‌سازی را فراهم می‌آورد (Heid et al., 1996). روش‌های هم‌دما مانند تکثیر هم‌دمای با واسطه حلقه، در یک دمای واحد تکثیر می‌شوند و نیاز به چرخه‌زنی حرارتی را از بین می‌برند (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

تکنیک‌های تکثیر به طور گسترده‌ای برای تشخیص عوامل بیماری‌زا و شناسایی اهداف ژنتیکی در آزمایشگاه‌های تشخیصی استفاده می‌شوند. این مدخل نحوه عملکرد تکثیر و نحوه گزارش عملکرد آن را توضیح می‌دهد؛ این یک مرجع روش‌شناختی است و راهنمایی برای سفارش یا تفسیر هیچ آزمایش خاصی در مراقبت از بیمار ارائه نمی‌دهد.

Evidence & guidelines

دستورالعمل‌های MIQE (Bustin et al., 2009) حداقل اطلاعات مورد نیاز برای گزارش آزمایش‌های PCR کمی بلادرنگ را مشخص می‌کنند و یک مرجع پرکاربرد برای شفافیت و قابلیت بازتولید هستند. مطالعات اولیه بنیادی، روش اصلی PCR و کمی‌سازی بلادرنگ را توصیف می‌کنند (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996)، در حالی که کارهای بعدی جایگزین‌های هم‌دما را معرفی کردند (Notomi et al., 2000).

History

PCR توسط کاری مولیس ابداع شد و اولین بار توسط سایکی و همکارانش در سال 1985 برای یک مشکل تشخیصی — تشخیص جهش سلول داسی‌شکل — به کار گرفته شد، و این روش به طور رسمی در سال 1986 توصیف شد (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). معرفی پلیمرازهای مقاوم به حرارت، فرآیند را خودکار کرد، و تشخیص بلادرنگ در دهه 1990 قابلیت کمی‌سازی را اضافه کرد (Heid et al., 1996). تکنیک‌های هم‌دما بعداً تکثیر را به محیط‌هایی بدون ترموسایکلر گسترش دادند (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

چرا PCR یک هدف را به صورت نمایی تکثیر می‌کند؟

هر چرخه هر رشته موجود از هدف را کپی می‌کند، بنابراین تعداد کپی‌ها تقریباً در هر دور دو برابر می‌شود؛ پس از چرخه‌های زیاد، توالی که با چند مولکول آغاز شده بود می‌تواند به میلیاردها کپی برسد.

تکثیر هم‌دما چه تفاوتی با PCR دارد؟

روش‌های هم‌دما مانند تکثیر هم‌دمای با واسطه حلقه، DNA را در یک دمای ثابت و با استفاده از آغازگرها و آنزیم‌های تخصصی تکثیر می‌کنند و نیاز به چرخه‌های مکرر گرمایش و سرمایش که PCR متداول به آن نیاز دارد را از بین می‌برند.