تشخیص مولکولی: PCR، RT-PCR و تکثیر اسید نوکلئیک
تشخیص مولکولی یک ویروس را با تکثیر و شناسایی اسید نوکلئیک آن ردیابی میکند. واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) و برای ویروسهای RNA، واکنش زنجیرهای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR)، توالی ژنومی هدف را میلیونها بار کپی میکنند تا حتی مقادیر بسیار کم ژنوم ویروسی نیز قابل تشخیص شوند. این امر به این روشها حساسیت و ویژگی بالایی میبخشد و آنها را به ستون فقرات تشخیص ویروسی مدرن تبدیل میکند.
Definition
تشخیص مولکولی، ردیابی و در صورت نیاز، اندازهگیری کمی اسید نوکلئیک ویروسی با استفاده از تکنیکهای تکثیر مانند PCR، RT-PCR و روشهای ایزوترمال است که یک هدف ژنومی خاص را تا سطوح قابل تشخیص کپی میکنند.
Scope
این موضوع تکنیکهای تکثیر اسید نوکلئیک مورد استفاده در ویروسشناسی را پوشش میدهد: PCR معمولی و بلادرنگ، PCR رونویسی معکوس برای ویروسهای RNA، اندازهگیری کمی بار ویروسی، و جایگزینهای ایزوترمال مانند تکثیر با واسطه حلقه. این مطلب اصول و تفسیر را در سطح مرجع توضیح میدهد و پروتکلهای آزمایش یا توصیههای مدیریت بالینی را ارائه نمیدهد.
Core questions
- چگونه تکثیر یک توالی هدف، ویروس را از مقدار اولیه بسیار کم قابل تشخیص میکند؟
- یک ویروس RNA در مقایسه با یک ویروس DNA به چه مرحله اضافی نیاز دارد؟
- چگونه از PCR بلادرنگ برای اندازهگیری کمی بار ویروسی استفاده میشود و آستانه چرخه به چه معناست؟
- چه زمانی فرمتهای ایزوترمال یا چندگانه بر PCR معمولی ترجیح داده میشوند؟
Key concepts
- واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)
- رونویسی معکوس (RT-PCR)
- آغازگرها و ویژگی هدف
- چرخه حرارتی و تکثیر تصاعدی
- PCR بلادرنگ (کمی)
- آستانه چرخه و بار ویروسی
- تکثیر چندگانه
- تکثیر ایزوترمال (مثلاً LAMP)
Mechanisms
PCR از دو آغازگر کوتاه که یک ناحیه انتخابی از ژنوم ویروسی را احاطه میکنند، یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت، و چرخههای مکرر گرمایش و سرمایش استفاده میکند. هر چرخه DNA را واسرشت میکند، آغازگرها را متصل میکند و رشتههای جدید را گسترش میدهد و هدف را دو برابر میکند تا به صورت تصاعدی انباشته شود. برای ویروسهای RNA، یک مرحله رونویسی معکوس ابتدا ژنوم RNA را قبل از تکثیر به DNA مکمل تبدیل میکند. PCR بلادرنگ، انباشت محصول را چرخه به چرخه با استفاده از گزارشگرهای فلورسنت نظارت میکند و امکان اندازهگیری کمی را فراهم میآورد: آستانه چرخه که در آن سیگنال بالاتر از پسزمینه میرود، با مقدار الگوی اولیه رابطه معکوس دارد و تخمینی از بار ویروسی ارائه میدهد. طرحهای چندگانه چندین هدف را به طور همزمان تکثیر میکنند، و روشهای ایزوترمال مانند تکثیر با واسطه حلقه، تکثیر را در دمای ثابت انجام میدهند و نیازهای ابزاری را برای آزمایشهای غیرمتمرکز کاهش میدهند.
Clinical relevance
تکثیر اسید نوکلئیک، تشخیص حساس و اختصاصی عفونت فعال ویروسی را فراهم میکند و از نظارت بر بار ویروسی که برای پیگیری عفونتها و پاسخ به درمان استفاده میشود، پشتیبانی میکند. این مدخل نحوه عملکرد روشها و نحوه تفسیر نتایج مانند آستانه چرخه را به طور اصولی توضیح میدهد، از جمله این نکته که تشخیص ژنوم به خودی خود وجود ویروس عفونی را اثبات نمیکند؛ این مطلب توصیفی از روششناسی است و مبنایی برای تصمیمگیریهای تشخیصی یا درمانی فردی نیست.
Epidemiology
RT-PCR بلادرنگ به روش مرجع برای تأیید عفونت SARS-CoV-2 تبدیل شد، و انتشار سریع آزمایشهای معتبر در اوایل سال ۲۰۲۰، امکان گسترش جهانی آزمایشهای مولکولی را فراهم آورد و نشان داد که چگونه تکثیر اسید نوکلئیک زیربنای تشخیص و نظارت بر شیوع بیماری است.
History
واکنش زنجیرهای پلیمراز توسط کاری مولیس ابداع شد و اولین بار توسط سایکی و همکارانش در سال ۱۹۸۵ برای تشخیص ژنتیکی به کار گرفته شد، و این روش توسط مولیس و فالونا در سال ۱۹۸۷ رسمی شد. PCR کمی بلادرنگ، که توسط هاید و همکارانش در سال ۱۹۹۶ توصیف شد، اندازهگیری کمی پیوسته را اضافه کرد، و روشهای ایزوترمال مانند تکثیر با واسطه حلقه، که توسط نوتومی و همکارانش در سال ۲۰۰۰ معرفی شد، دامنه مکانهایی که تکثیر میتوانست انجام شود را گسترش داد.
Key figures
- Kary Mullis
- Randall Saiki
- Christian Drosten
Related topics
Seminal works
- saiki-1985
- mullis-faloona-1987
- heid-1996
- corman-2020
Frequently asked questions
- تفاوت بین PCR و RT-PCR چیست؟
- PCR DNA را تکثیر میکند، بنابراین مستقیماً برای ویروسهای DNA استفاده میشود. RT-PCR یک مرحله رونویسی معکوس اضافه میکند که ابتدا ژنوم RNA ویروس را به DNA مکمل تبدیل میکند و امکان تشخیص ویروسهای RNA مانند آنفولانزا و کرونا ویروسها را فراهم میآورد.
- آیا نتیجه مثبت PCR به معنای وجود ویروس عفونی است؟
- لزوماً خیر. PCR ژنوم ویروسی را تشخیص میدهد که میتواند پس از اینکه ویروس دیگر تکثیر یا عفونی نیست، باقی بماند. اثبات وجود ویروس عفونی نیاز به کشت یا سایر آزمایشهای عملکردی دارد که در بافت بالینی تفسیر میشوند.