تجزیه و تحلیل کمی بلادرنگ و ارزیابی تعداد کپی

روش‌های مولکولی کمی، میزان حضور یک اسید نوکلئیک هدف را اندازه‌گیری می‌کنند، نه صرفاً اینکه آیا قابل تشخیص است یا خیر. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی بلادرنگ (Real-time quantitative PCR) تکثیر را در حین وقوع ردیابی می‌کند، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز دیجیتال (digital PCR) یک نمونه را برای شمارش مطلق مولکول‌ها تقسیم‌بندی می‌کند، و ارزیابی تعداد کپی (copy-number assessment) تعیین می‌کند که آیا یک ناحیه ژنومی افزایش یا کاهش یافته است.

Definition

تجزیه و تحلیل کمی بلادرنگ، مقدار یک اسید نوکلئیک هدف را اندازه‌گیری می‌کند، معمولاً با نظارت بر سیگنال فلورسنت در طول تکثیر (PCR بلادرنگ) یا با شمارش بخش‌های مثبت (PCR دیجیتال)؛ ارزیابی تعداد کپی، تعداد کپی‌های یک ناحیه ژنومی را نسبت به یک مرجع تعیین می‌کند.

Scope

این موضوع شامل واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بلادرنگ (کمی)، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز دیجیتال و دیجیتال قطره‌ای، و رویکردهای ارزیابی تعداد کپی است. این مبحث به اصول کمی‌سازی و ملاحظاتی که نتایج را قابل مقایسه می‌سازد، می‌پردازد که به عنوان یک مرجع روش‌شناختی ارائه شده است تا راهنمای آزمایش بالینی.

Key concepts

• PCR بلادرنگ (کمی)
• چرخه کمی‌سازی (Cq) و کارایی تکثیر
• منحنی‌های استاندارد و کمی‌سازی نسبی
• PCR دیجیتال و دیجیتال قطره‌ای
• کمی‌سازی مطلق با تقسیم‌بندی
• افزایش و کاهش تعداد کپی
• استانداردهای گزارش‌دهی و قابلیت تکرار

Mechanisms

PCR بلادرنگ، تکثیر را با یک گزارشگر فلورسنت جفت می‌کند که سیگنال آن متناسب با تجمع محصول افزایش می‌یابد؛ چرخه‌ای که در آن سیگنال از یک آستانه عبور می‌کند، منعکس‌کننده مقدار اولیه هدف است و امکان کمی‌سازی نسبی یا با منحنی استاندارد را فراهم می‌کند (Heid et al., 1996). PCR دیجیتال به جای آن، نمونه را به بسیاری از بخش‌های کوچک تقسیم می‌کند به طوری که هر کدام حاوی صفر یا چند مولکول باشند؛ شمارش کسر بخش‌های مثبت و اعمال آمار پواسون، یک شمارش مطلق را بدون منحنی استاندارد به دست می‌دهد (Hindson et al., 2011). ارزیابی تعداد کپی، فراوانی یک ناحیه هدف را با یک مرجع مقایسه می‌کند تا تکثیرها یا حذف‌ها را شناسایی کند، ایده‌ای که توسط هیبریداسیون ژنومی مقایسه‌ای (Kallioniemi et al., 1992) پیشگام شد.

Clinical relevance

روش‌های کمی و تعداد کپی برای اندازه‌گیری بار پاتوژن، بیان ژن، و افزایش یا کاهش‌های ژنومی استفاده می‌شوند. این مدخل نحوه عملکرد کمی‌سازی را به عنوان یک مرجع روش‌شناختی توضیح می‌دهد؛ در مورد انتخاب، تفسیر، یا اقدام بر اساس هر آزمایش کمی خاص در مراقبت از بیمار توصیه‌ای نمی‌کند.

Evidence & guidelines

گزارش‌دهی PCR کمی توسط توصیه‌های MIQE هدایت می‌شود، که حداقل اطلاعات مورد نیاز برای انتشار قابل تکرار را مشخص می‌کند (Bustin et al., 2009). مطالعات اولیه بنیادی، کمی‌سازی بلادرنگ (Heid et al., 1996)، کمی‌سازی دیجیتال مطلق (Hindson et al., 2011)، و اندازه‌گیری تعداد کپی در سراسر ژنوم (Kallioniemi et al., 1992) را توصیف می‌کنند.

History

PCR بلادرنگ در اواسط دهه 1990، تکثیر را از یک ابزار کیفی به یک ابزار کمی تبدیل کرد (Heid et al., 1996)، و استانداردهای گزارش‌دهی اجماعی یک دهه بعد دنبال شد (Bustin et al., 2009). سپس PCR دیجیتال، و به ویژه PCR دیجیتال قطره‌ای، شمارش مطلق مولکول‌ها را با دقت بالا امکان‌پذیر ساخت (Hindson et al., 2011)، در حالی که ارزیابی تعداد کپی از هیبریداسیون ژنومی مقایسه‌ای به سمت روش‌های مبتنی بر آرایه و توالی‌یابی تکامل یافت (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

PCR دیجیتال چه تفاوتی با PCR کمی بلادرنگ دارد؟

PCR بلادرنگ مقدار اولیه هدف را از زمان عبور سیگنال فلورسنت از یک آستانه، معمولاً نسبت به یک استاندارد، تخمین می‌زند، در حالی که PCR دیجیتال نمونه را تقسیم‌بندی کرده و محفظه‌های مثبت را می‌شمارد تا یک شمارش مطلق مولکولی را بدون منحنی استاندارد ارائه دهد.

ارزیابی تعداد کپی چه چیزی را اندازه‌گیری می‌کند؟

این روش تعیین می‌کند که چند کپی از یک ناحیه ژنومی خاص نسبت به یک مرجع وجود دارد و افزایش‌ها (گین‌ها) یا حذف‌ها (لوس‌ها) در آن ناحیه را شناسایی می‌کند.