توالییابی RNA و ترانسکریپتومیکس
توالییابی RNA (RNA-seq) با توالییابی با توان عملیاتی بالا، هویت و فراوانی مولکولهای RNA را در یک نمونه تعیین میکند و تصویری کمی و در سطح ژنوم از بیان ژن ارائه میدهد. ترانسکریپتومیکس مطالعه این مجموعه کامل از رونوشتها، یعنی ترانسکریپتوم، و نحوه تغییر آن بین بافتها، شرایط و وضعیتهای بیماری است.
Definition
توالییابی RNA روشی است که RNA را به کتابخانهای از قطعات توالییابی شده تبدیل میکند و تعداد خوانشهای نگاشت شده به ژنها یا رونوشتها را برای کمیسازی بیان در سراسر ترانسکریپتوم، یعنی مجموعه کامل مولکولهای RNA موجود در یک سلول یا بافت، شمارش میکند.
Scope
این موضوع به چگونگی تبدیل توالیهای خوانده شده RNA-seq به تخمینهای بیان، معنای ترانسکریپتوم به عنوان یک خوانش پویا، واحدهای کمیسازی رایج، و مسائل کیفیت و استانداردسازی خاص اندازهگیری مبتنی بر توالییابی میپردازد. این موضوع RNA-seq را به عنوان یک پلتفرم اندازهگیری و کشف در نظر میگیرد تا یک پروتکل آزمایش بالینی.
Core questions
- چگونه خوانشهای توالییابی به تخمینهای کمی بیان تبدیل میشوند؟
- ترانسکریپتوم فراتر از یک لیست ثابت از ژنها چه چیزی را شامل میشود؟
- چگونه نرمالسازی و عمق خوانش بر قابلیت مقایسه تأثیر میگذارند؟
- دقت و قابلیت تکرار RNA-seq چگونه ارزیابی میشود؟
Key concepts
- ترانسکریپتوم
- نگاشت و شمارش خوانش
- نرمالسازی (مانند مقیاسبندی عمق و طول)
- بیان افتراقی
- کنترلهای اسپایک-این
- ترانسکریپتومیکس تکسلولی و تودهای
Mechanisms
RNA استخراج شده، به cDNA رونویسی معکوس میشود، قطعهقطعه شده و به یک کتابخانه توالییابی آماده میشود؛ خوانشهای حاصل به یک ژنوم یا ترانسکریپتوم مرجع همتراز میشوند و تعداد خوانشهای همپوشان با هر ویژگی، عددی متناسب با بیان آن را فراهم میکند (Mortazavi et al., 2008). از آنجا که عمق کل خوانش و طول رونوشت بر شمارشهای خام تأثیر میگذارد، دادهها قبل از مقایسه رونوشتها نرمالسازی میشوند و فراوانی اغلب در واحدهای مقیاسبندی شده بر اساس طول و عمق بیان میشود. RNA-seq میتواند رونوشتهای جدید، واریانتهای پیرایش و طیف وسیعی از بیان پویا را شناسایی کند که آن را از پروفایلسازی مبتنی بر هیبریداسیون قبلی متمایز میکند (Wang et al., 2009). استانداردهای اسپایک-این خارجی و بنچمارکینگ کنسرسیوم برای مشخص کردن دقت و محدودیتهای پلتفرم استفاده میشوند (Jiang et al., 2011; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).
Clinical relevance
RNA-seq به طور فزایندهای زیربنای پروفایلسازی مولکولی تومور، تشخیص همجوشی و طبقهبندی مبتنی بر بیان است و تفسیر چنین دادههایی مستلزم درک چگونگی تبدیل شمارشها به تخمینهای بیان است. این مدخل روش و ویژگیهای کمی آن را توصیف میکند؛ اما تفاسیر تشخیصی یا راهنمایی درمانی ارائه نمیدهد، که بر آزمایشهای معتبر و معیارهای بالینی استوار است.
Evidence & guidelines
توصیفات بنیادی RNA-seq به عنوان یک روش کمی (Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009) با تلاشهای جامعه در زمینه دقت و قابلیت تکرار، از جمله استانداردهای اسپایک-این خارجی (Jiang et al., 2011) و بنچمارکینگ SEQC/MAQC-III از عملکرد RNA-seq (2014) تکمیل میشوند.
History
اندازهگیری ترانسکریپتوم از رویکردهای برچسب توالی بیان شده و ریزآرایه به توالییابی مستقیم در اواخر دهه 2000 منتقل شد، زمانی که توالییابی نسل بعدی شمارش خوانش کل ترانسکریپتوم را عملی کرد (Mortazavi et al., 2008). RNA-seq به سرعت به یک استاندارد برای مطالعات بیان تبدیل شد و کار کنسرسیوم بعدی به چگونگی قابل مقایسه و قابل تکرار کردن اندازهگیریهای آن پرداخت (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).
Debates
- شمارشهای RNA-seq چگونه باید برای مقایسه نرمالسازی شوند؟
- شمارشهای خام به عمق توالییابی و طول رونوشت بستگی دارند و انتخابهای مختلف نرمالسازی میتوانند ژنهایی را که به صورت افتراقی بیان میشوند تغییر دهند؛ انتخاب نرمالسازی و کنترلهای مناسب همچنان یک نگرانی روششناختی است.
Key figures
- Zhong Wang
- Michael Snyder
- Ali Mortazavi
- Barbara Wold
Related topics
Seminal works
- wang-2009
- mortazavi-2008
- seqc-2014
Frequently asked questions
- ترانسکریپتوم چیست؟
- ترانسکریپتوم مجموعه کامل رونوشتهای RNA موجود در یک سلول یا بافت در یک زمان معین است؛ از آنجا که با شرایط و نوع سلول تغییر میکند، اندازهگیری آن نشان میدهد که کدام ژنها فعال هستند و در چه سطحی.
- RNA-seq چگونه با ریزآرایهها برای بیان تفاوت دارد؟
- RNA-seq به طور مستقیم RNA را توالییابی و شمارش میکند، بنابراین میتواند رونوشتهای جدید و واریانتهای پیرایش را شناسایی کند و طیف وسیعی از بیان پویا را پوشش میدهد، در حالی که ریزآرایهها هیبریداسیون را به پروبهای از پیش تعریف شده اندازهگیری میکنند و به توالیهای شناخته شده محدود میشوند.
Methods for this concept
- RNA-seq Differential Expression
- Single-cell RNA-seq analysis
- Bayesian RNA-seq differential expression
- Time-series single-cell RNA-seq analysis
- De Novo Transcriptome Assembly
- Differential single-cell RNA-seq analysis
- Multi-omics RNA-seq differential expression
- Machine learning-assisted RNA-seq differential expression