Real-Time PCR und Quantitative PCR Anwendungen

Die Real-Time PCR, auch als quantitative PCR (qPCR) bezeichnet, misst die Akkumulation von amplifizierter DNA Zyklus für Zyklus mittels eines Fluoreszenzsignals, wodurch die Ausgangsmenge einer Zielsequenz geschätzt werden kann. In Kombination mit der Reversen Transkription (RT-qPCR) ist sie eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Quantifizierung der Genexpression in der molekularen Pathologie.

Definition

Die Real-Time quantitative PCR ist eine Nukleinsäure-Amplifikationsmethode, die die Produktbildung in Echtzeit über Fluoreszenz überwacht und den Quantifizierungszyklus verwendet, um die anfängliche Menge eines DNA- oder (nach Reverser Transkription) RNA-Targets zu schätzen.

Scope

Dieses Thema behandelt das Messprinzip der Real-Time PCR, den Quantifizierungszyklus (Cq) und seine Beziehung zur Template-Menge, die relative Quantifizierung mittels der komparativen 2-DDCT-Methode, die Rolle von Referenzgenen und der Amplifikationseffizienz sowie die Berichtsstandards, die die Reproduzierbarkeit regeln. Es wird auch die digitale PCR als verwandter Ansatz zur absoluten Quantifizierung erwähnt. Diese werden als Labormethoden und nicht als klinische Testprotokolle behandelt.

Core questions

• Wie hängt der Quantifizierungszyklus mit der Menge des Ausgangs-Templates zusammen?
• Wie wird die relative Expression in der RT-qPCR berechnet und normalisiert?
• Warum beeinflussen die Amplifikationseffizienz und die Wahl des Referenzgens das Ergebnis?
• Wie unterscheidet sich die digitale PCR von der Real-Time PCR bei der Quantifizierung?

Key concepts

• Quantifizierungszyklus (Cq / Ct)
• Amplifikationseffizienz
• Komparative 2-DDCT-Methode
• Referenzgene (Housekeeping-Gene)
• Reverse-Transkriptions-qPCR
• Digitale PCR und Partitionierung
• MIQE-Berichtsstandards

Mechanisms

Während der PCR verdoppelt sich die Zielsequenz in der exponentiellen Phase in jedem Zyklus, und ein fluoreszierender Reporter (ein interkalierender Farbstoff oder eine sequenzspezifische Sonde) sendet ein Signal aus, das proportional zum akkumulierten Produkt ist. Der Zyklus, bei dem die Fluoreszenz einen definierten Schwellenwert überschreitet (der Quantifizierungszyklus, Cq oder Ct), ist umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangs-Template-Menge, sodass ein niedrigerer Cq mehr Target bedeutet. Die relative Expression wird am häufigsten mit der komparativen 2-DDCT-Methode berechnet, die den Cq des Targets an ein Referenzgen und an eine Kalibratorprobe normalisiert, wobei nahezu gleiche Amplifikationseffizienzen angenommen werden (Livak & Schmittgen, 2001). Da Effizienz, Stabilität des Referenzgens und Variabilität der Reversen Transkription die Schätzung beeinflussen, legen die MIQE-Richtlinien die experimentellen Details und die Validierung fest, die für die Interpretierbarkeit eines Ergebnisses erforderlich sind (Bustin et al., 2009). Die digitale PCR teilt die Probe stattdessen in viele Reaktionen auf und zählt positive Partitionen, was eine absolute Quantifizierung ohne Standardkurve ermöglicht (Huggett et al., 2013).

Clinical relevance

Die RT-qPCR ist eine Routineplattform zur Messung von Transkriptspiegeln, die molekularen diagnostischen und prognostischen Auswertungen zugrunde liegen, und das Verständnis ihrer Annahmen ist Teil der Interpretation von Laborberichten. Dieser Eintrag erklärt die Methode und ihre Einschränkungen und ist keine Grundlage für diagnostische Grenzwerte oder das Patientenmanagement, die von validierten Assays abhängen.

Evidence & guidelines

Berichts- und Qualitätsanforderungen für die Real-Time PCR sind in den MIQE-Richtlinien (Bustin et al., 2009) und für die digitale PCR in den digitalen MIQE-Richtlinien (Huggett et al., 2013) festgelegt. Die komparative 2-DDCT-Methode (Livak & Schmittgen, 2001) bleibt die Standardreferenz für die relative Quantifizierung.

History

Die Real-Time PCR entstand in den 1990er Jahren, als die Fluoreszenzdetektion mit der thermischen Zyklisierung gekoppelt wurde und die arbeitsintensive Endpunktquantifizierung ersetzte. Die komparative 2-DDCT-Methode (2001) standardisierte die relative Quantifizierung, die MIQE-Richtlinien (2009) befassten sich mit weit verbreiteten Reproduzierbarkeitsproblemen, und die digitale PCR erweiterte das Feld später in Richtung absoluter Quantifizierung.

Debates

Wie sollten Referenzgene für die Normalisierung ausgewählt werden?

Die relative Quantifizierung setzt eine stabile Referenzgenexpression über verschiedene Bedingungen hinweg voraus, aber einzelne Housekeeping-Gene können variieren; die Verwendung validierter multipler Referenzgene wird empfohlen, um eine voreingenommene Normalisierung zu vermeiden.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

Was bedeutet ein niedrigerer Ct-Wert?

Ein niedrigerer Quantifizierungszyklus (Ct oder Cq) bedeutet, dass die Fluoreszenz den Schwellenwert früher überschreitet, was auf mehr Ausgangs-Target-Template hindeutet; Ct ist umgekehrt proportional zum Logarithmus der Ausgangsmenge.

Wie unterscheidet sich die digitale PCR von der Real-Time qPCR?

Die digitale PCR teilt die Reaktion in viele kleine Kompartimente auf und zählt, wie viele davon das Target enthalten, was eine absolute Zählung ohne Standardkurve ermöglicht, während die Real-Time qPCR die Menge aus dem Quantifizierungszyklus ableitet, üblicherweise als relatives Maß.