PCR und Nukleinsäure-Amplifikationstechniken

Nukleinsäure-Amplifikationstechniken vervielfältigen eine gewählte DNA- oder RNA-Sequenz um ein Vielfaches, sodass ein in Spuren vorhandenes Ziel nachweisbar und messbar wird. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist der Archetyp: Durch wiederholte Zyklen von Denaturierung, Primer-Annealing und Polymerase-Extension führt sie zu einer exponentiellen Zunahme einer definierten Sequenz und ist damit ein Eckpfeiler der molekularen Diagnostik.

Definition

Nukleinsäure-Amplifikationstechniken sind In-vitro-Methoden, die enzymatisch viele Kopien einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz erzeugen, wobei die PCR thermisches Cycling und eine DNA-Polymerase verwendet, um eine durch zwei Primer definierte Region zu amplifizieren.

Scope

Das Thema umfasst die konventionelle Endpunkt-PCR, die Echtzeit- (quantitative) PCR, die Reverse-Transkriptions-PCR für RNA-Ziele und isotherme Alternativen wie die Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP). Es behandelt die Prinzipien, Komponenten und Berichtsüberlegungen der Amplifikation als methodische Referenz, nicht als Assay-Protokolle oder klinische Leitlinien.

Key concepts

• Thermisches Cycling (Denaturierung, Annealing, Extension)
• Primer und DNA-Polymerase
• Exponentielle Amplifikation
• Reverse-Transkriptions-PCR für RNA-Ziele
• Echtzeit- (quantitative) PCR
• Isotherme Amplifikation (z.B. LAMP)
• Kontaminationskontrolle und falsch positive Ergebnisse

Mechanisms

Bei der PCR wird doppelsträngige DNA durch Hitze in Einzelstränge denaturiert, kurze Oligonukleotid-Primer lagern sich an Sequenzen an, die das Ziel flankieren, und eine thermostabile DNA-Polymerase verlängert die Primer, um neue komplementäre Stränge zu synthetisieren; die Wiederholung des Zyklus verdoppelt das Ziel in jeder Runde, was zu einer exponentiellen Amplifikation führt (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). RNA-Ziele werden vor der Amplifikation zunächst durch Reverse Transkriptase in komplementäre DNA umgewandelt. Die Echtzeit-PCR überwacht die Produktakkumulation Zyklus für Zyklus mithilfe fluoreszierender Reporter, was eine Quantifizierung ermöglicht (Heid et al., 1996). Isotherme Methoden wie die Loop-mediated Isothermal Amplification amplifizieren bei einer einzigen Temperatur, wodurch die Notwendigkeit des thermischen Cyclings entfällt (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

Amplifikationstechniken werden in diagnostischen Laboren häufig zum Nachweis von Pathogenen und zur Charakterisierung genetischer Ziele eingesetzt. Dieser Eintrag beschreibt, wie die Amplifikation funktioniert und wie ihre Leistung berichtet wird; er ist eine methodische Referenz und bietet keine Anleitung zur Anordnung oder Interpretation spezifischer Tests in der Patientenversorgung.

Evidence & guidelines

Die MIQE-Richtlinien (Bustin et al., 2009) legen die Mindestinformationen fest, die für die Berichterstattung über quantitative Echtzeit-PCR-Experimente erforderlich sind, und sind eine weithin zitierte Referenz für Transparenz und Reproduzierbarkeit. Grundlegende Primärstudien beschreiben die ursprüngliche PCR-Methode und die Echtzeit-Quantifizierung (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996), während spätere Arbeiten isotherme Alternativen einführten (Notomi et al., 2000).

History

Die PCR wurde von Kary Mullis konzipiert und 1985 von Saiki und Kollegen erstmals auf ein diagnostisches Problem – den Nachweis der Sichelzellmutation – angewendet, wobei die Methode 1986 formal beschrieben wurde (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Die Einführung thermostabiler Polymerasen automatisierte den Prozess, und der Echtzeit-Nachweis in den 1990er Jahren fügte quantitative Fähigkeiten hinzu (Heid et al., 1996). Isotherme Techniken erweiterten später die Amplifikation auf Umgebungen ohne Thermocycler (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

Warum amplifiziert die PCR ein Ziel exponentiell?

Jeder Zyklus kopiert jeden vorhandenen Strang des Ziels, sodass sich die Anzahl der Kopien in jeder Runde ungefähr verdoppelt; nach vielen Zyklen kann eine Sequenz, die als wenige Moleküle begann, Milliarden von Kopien erreichen.

Wie unterscheidet sich die isotherme Amplifikation von der PCR?

Isotherme Methoden wie die Loop-mediated Isothermal Amplification amplifizieren DNA bei einer einzigen konstanten Temperatur unter Verwendung spezialisierter Primer und Enzyme, wodurch die Notwendigkeit der wiederholten Heiz- und Kühlzyklen entfällt, die die konventionelle PCR erfordert.