Molekulare Diagnostik: PCR, RT-PCR und Nukleinsäureamplifikation

Die molekulare Diagnostik weist ein Virus durch Amplifikation und Identifizierung seiner Nukleinsäure nach. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und, bei RNA-Viren, die Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) kopieren eine Zielgenomsequenz millionenfach, sodass selbst sehr geringe Mengen viralen Genoms nachweisbar werden. Dies verleiht diesen Methoden eine hohe Sensitivität und Spezifität und macht sie zum Eckpfeiler der modernen Virusdiagnostik.

Definition

Molekulare Diagnostik ist der Nachweis und, falls erforderlich, die Quantifizierung viraler Nukleinsäuren mittels Amplifikationstechniken wie PCR, RT-PCR und isothermen Methoden, die ein spezifisches Genomziel auf nachweisbare Mengen kopieren.

Scope

Dieses Thema behandelt Nukleinsäureamplifikationstechniken, die in der Virologie eingesetzt werden: konventionelle und Echtzeit-PCR, Reverse-Transkriptase-PCR für RNA-Viren, quantitative Messung der Viruslast und isotherme Alternativen wie die Loop-mediated Amplification. Es erläutert die Prinzipien und die Interpretation auf Referenzniveau und bietet keine Assay-Protokolle oder Ratschläge zur klinischen Behandlung.

Core questions

• Wie macht die Amplifikation einer Zielsequenz ein Virus aus einer winzigen Ausgangsmenge nachweisbar?
• Welchen zusätzlichen Schritt benötigt ein RNA-Virus im Vergleich zu einem DNA-Virus?
• Wie wird die Echtzeit-PCR zur Quantifizierung der Viruslast eingesetzt und was bedeutet der Zyklusschwellenwert?
• Wann sind isotherme oder Multiplex-Formate der konventionellen PCR vorzuziehen?

Key concepts

• Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
• Reverse Transkription (RT-PCR)
• Primer und Zielspezifität
• Thermische Zyklen und exponentielle Amplifikation
• Echtzeit- (quantitative) PCR
• Zyklusschwellenwert und Viruslast
• Multiplex-Amplifikation
• Isotherme Amplifikation (z. B. LAMP)

Mechanisms

Die PCR verwendet zwei kurze Primer, die eine ausgewählte Region des viralen Genoms flankieren, eine thermostabile DNA-Polymerase und wiederholte Zyklen von Erhitzen und Abkühlen. Jeder Zyklus denaturiert die DNA, annealiert die Primer und verlängert neue Stränge, wodurch das Ziel verdoppelt wird und exponentiell akkumuliert. Bei RNA-Viren wandelt ein Reverse-Transkriptionsschritt das RNA-Genom vor der Amplifikation zunächst in komplementäre DNA um. Die Echtzeit-PCR überwacht die Produktakkumulation Zyklus für Zyklus mithilfe fluoreszierender Reporter, was eine Quantifizierung ermöglicht: Der Zyklusschwellenwert, bei dem das Signal über den Hintergrund ansteigt, korreliert invers mit der Menge der Ausgangsmatrize und liefert eine Schätzung der Viruslast. Multiplex-Designs amplifizieren mehrere Ziele gleichzeitig, und isotherme Methoden wie die Loop-mediated Amplification erreichen die Amplifikation bei konstanter Temperatur, wodurch die Anforderungen an die Instrumentierung für dezentrale Tests reduziert werden.

Clinical relevance

Die Nukleinsäureamplifikation ermöglicht den sensitiven und spezifischen Nachweis einer aktiven Virusinfektion und unterstützt die Überwachung der Viruslast, die zur Verfolgung von Infektionen und des Therapieansprechens eingesetzt wird. Dieser Eintrag beschreibt, wie die Methoden funktionieren und wie Ergebnisse wie der Zyklusschwellenwert prinzipiell interpretiert werden, einschließlich des Hinweises, dass der Genomnachweis allein nicht beweist, dass infektiöses Virus vorhanden ist; er ist deskriptiv bezüglich der Methodik und keine Grundlage für individuelle diagnostische oder therapeutische Entscheidungen.

Epidemiology

Die Echtzeit-RT-PCR wurde zur Referenzmethode für die Bestätigung einer SARS-CoV-2-Infektion, und die schnelle Veröffentlichung validierter Assays Anfang 2020 ermöglichte die globale Ausweitung molekularer Tests, was verdeutlicht, wie die Nukleinsäureamplifikation die Erkennung und Überwachung von Ausbrüchen untermauert.

History

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde von Kary Mullis konzipiert und 1985 von Saiki und Kollegen erstmals in der genetischen Diagnostik angewendet, wobei die Methode 1987 von Mullis und Faloona formalisiert wurde. Die von Heid und Kollegen 1996 beschriebene quantitative Echtzeit-PCR fügte eine kontinuierliche Quantifizierung hinzu, und isotherme Methoden wie die Loop-mediated Amplification, die 2000 von Notomi und Kollegen eingeführt wurden, erweiterten die Möglichkeiten, wo die Amplifikation durchgeführt werden konnte.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

Was ist der Unterschied zwischen PCR und RT-PCR?

Die PCR amplifiziert DNA und wird daher direkt für DNA-Viren eingesetzt. Die RT-PCR fügt einen Reverse-Transkriptionsschritt hinzu, der das RNA-Genom eines Virus zunächst in komplementäre DNA umwandelt, wodurch RNA-Viren wie Influenza- und Coronaviren nachweisbar werden.

Bedeutet ein positives PCR-Ergebnis, dass infektiöses Virus vorhanden ist?

Nicht unbedingt. Die PCR weist virales Genom nach, das auch dann noch vorhanden sein kann, wenn ein Virus nicht mehr repliziert oder infektiös ist. Der Nachweis von infektiösem Virus erfordert eine Kultur oder andere funktionelle Assays, die im klinischen Kontext interpretiert werden.