Echtzeit-Quantifizierung und Kopienzahlbestimmung

Quantitative molekulare Methoden messen, wie viel einer Zielnukleinsäure vorhanden ist, anstatt lediglich festzustellen, ob sie nachweisbar ist. Die quantitative Echtzeit-PCR verfolgt die Amplifikation während ihres Verlaufs, die digitale PCR teilt eine Probe auf, um Moleküle absolut zu zählen, und die Kopienzahlbestimmung ermittelt, ob eine genomische Region gewonnen oder verloren wurde.

Definition

Die quantitative Echtzeitanalyse misst die Menge einer Zielnukleinsäure, typischerweise durch Überwachung des Fluoreszenzsignals während der Amplifikation (Echtzeit-PCR) oder durch Zählen positiver Partitionen (digitale PCR); die Kopienzahlbestimmung ermittelt die Anzahl der Kopien einer genomischen Region relativ zu einer Referenz.

Scope

Das Thema umfasst die Echtzeit- (quantitative) PCR, die digitale und die Tröpfchen-Digital-PCR sowie Ansätze zur Kopienzahlbestimmung. Es behandelt die Prinzipien der Quantifizierung und die Überlegungen, die Ergebnisse vergleichbar machen, dargestellt als methodisches Referenzmaterial und nicht als Leitfaden für klinische Tests.

Key concepts

• Echtzeit- (quantitative) PCR
• Quantifizierungszyklus (Cq) und Amplifikationseffizienz
• Standardkurven und relative Quantifizierung
• Digitale und Tröpfchen-Digital-PCR
• Absolute Quantifizierung durch Partitionierung
• Kopienzahlgewinne und -verluste
• Berichtsstandards und Reproduzierbarkeit

Mechanisms

Die Echtzeit-PCR koppelt die Amplifikation an einen fluoreszierenden Reporter, dessen Signal proportional zur Produktakkumulation ansteigt; der Zyklus, in dem das Signal einen Schwellenwert überschreitet, spiegelt die Ausgangsmenge des Targets wider, was eine relative oder Standardkurven-Quantifizierung ermöglicht (Heid et al., 1996). Die digitale PCR verteilt die Probe stattdessen in viele winzige Partitionen, sodass jede null oder wenige Moleküle enthält; das Zählen des Anteils positiver Partitionen und die Anwendung der Poisson-Statistik ergibt eine absolute Zählung ohne Standardkurve (Hindson et al., 2011). Die Kopienzahlbestimmung vergleicht die Abundanz einer Zielregion mit einer Referenz, um Amplifikationen oder Deletionen zu detektieren, eine Idee, die durch die komparative genomische Hybridisierung (Kallioniemi et al., 1992) entwickelt wurde.

Clinical relevance

Quantitative Methoden und Kopienzahlmethoden werden zur Messung der Erregerlast, der Genexpression und genomischer Zugewinne oder Verluste eingesetzt. Dieser Eintrag erläutert die Funktionsweise der Quantifizierung als methodische Referenz; er gibt keine Empfehlungen zur Auswahl, Interpretation oder Anwendung spezifischer quantitativer Assays in der Patientenversorgung.

Evidence & guidelines

Die Berichterstattung über quantitative PCR wird durch die MIQE-Empfehlungen geleitet, die die Mindestinformationen festlegen, die für eine reproduzierbare Veröffentlichung erforderlich sind (Bustin et al., 2009). Grundlegende Primärstudien beschreiben die Echtzeit-Quantifizierung (Heid et al., 1996), die absolute digitale Quantifizierung (Hindson et al., 2011) und die genomweite Kopienzahlmessung (Kallioniemi et al., 1992).

History

Die Echtzeit-PCR Mitte der 1990er Jahre verwandelte die Amplifikation von einem qualitativen in ein quantitatives Werkzeug (Heid et al., 1996), und konsensbasierte Berichtsstandards folgten ein Jahrzehnt später (Bustin et al., 2009). Die digitale PCR, insbesondere die Tröpfchen-Digital-PCR, ermöglichte dann die absolute Zählung von Molekülen mit hoher Präzision (Hindson et al., 2011), während sich die Kopienzahlbestimmung von der komparativen genomischen Hybridisierung hin zu Array- und Sequenzierungs-basierten Methoden entwickelte (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

Wie unterscheidet sich die digitale PCR von der quantitativen Echtzeit-PCR?

Die Echtzeit-PCR schätzt die Ausgangsmenge des Targets anhand dessen, wie früh das Fluoreszenzsignal einen Schwellenwert überschreitet, üblicherweise relativ zu einem Standard, während die digitale PCR die Probe partitioniert und positive Kompartimente zählt, um eine absolute Molekülzahl ohne Standardkurve zu liefern.

Was misst die Kopienzahlbestimmung?

Sie bestimmt, wie viele Kopien einer bestimmten genomischen Region relativ zu einer Referenz vorhanden sind, und identifiziert Amplifikationen (Gewinne) oder Deletionen (Verluste) dieser Region.