Molekulare Diagnostik: PCR und Sequenzierung

Molekulare Methoden detektieren und identifizieren Pilze anhand ihrer Nukleinsäuren und nicht anhand ihres Wachstums oder Aussehens. Die Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert Pilz-DNA aus Proben oder Isolaten, und die Sequenzierung konservierter Regionen, insbesondere des internen transkribierten Spacers des ribosomalen Genclusters, liest die amplifizierte DNA aus, um den Organismus zu benennen, oft schneller und präziser als die Kultur.

Definition

Molekulare Diagnostika für Pilze sind Techniken, die pilzliche Nukleinsäuren amplifizieren und analysieren, wobei PCR zur Detektion von Pilz-DNA und DNA-Sequenzierung konservierter Regionen wie dem internen transkribierten Spacer zur Identifizierung des Organismus bis zur Gattungs- oder Speziesebene eingesetzt werden.

Scope

Dieses Thema behandelt spezies-spezifische und breit-spektrale (panfungale) PCR, Real-Time PCR, DNA-Sequenzierung von Barcoding-Regionen wie dem ITS, und die Anwendung dieser Methoden auf Kulturisolate und direkt auf klinisches Material, einschließlich formalinfixiertem Gewebe. Es stellt diese als Identifizierungs- und Detektionsmethoden dar und bietet keine Test- oder Behandlungsanweisungen.

Core questions

• Ist Pilz-DNA in dieser Probe vorhanden, und von welchem Organismus stammt sie?
• Wann ist eine breit-spektrale panfungale PCR einer spezies-spezifischen Analyse vorzuziehen?
• Welche genomische Region diskriminiert die interessierenden Pilze am besten?
• Wie werden molekulare Ergebnisse angesichts der Risiken von Kontamination und des Nachweises nicht-lebensfähiger DNA interpretiert?

Key concepts

• Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
• Spezies-spezifische versus breit-spektrale (panfungale) PCR
• Real-Time (quantitative) PCR
• Interner transkribierter Spacer (ITS) als Pilz-Barcode
• DNA-Sequenzierung und Referenzdatenbanken
• Nachweis an Isolaten versus direkt an Gewebe
• Kontaminationskontrolle und Interpretation von zellfreier DNA

Mechanisms

Die PCR verwendet Primer und eine thermostabile Polymerase, um Ziel-DNA durch wiederholte Zyklen zu amplifizieren, wodurch genügend Kopien erzeugt werden, um selbst geringe Mengen an pilzlichem genetischem Material nachzuweisen. Spezies-spezifische Assays zielen auf einen bekannten Organismus ab, während breit-spektrale oder panfungale Assays Primer gegen konservierte Regionen verwenden, die von vielen Pilzen geteilt werden, wonach die Sequenzierung die Identität aufdeckt. Die interne transkribierte Spacer-Region des ribosomalen RNA-Genclusters, flankiert von konservierten Primern, die von White und Kollegen beschrieben wurden, ist zwischen den Spezies variabel genug, um als universeller Pilz-Barcode zu fungieren, und die ausgelesene Sequenz wird mit Referenzdatenbanken abgeglichen, um den Organismus zu benennen. Die Real-Time PCR fügt Quantifizierung und Geschwindigkeit hinzu, und Assays können an kultivierten Isolaten oder direkt an klinischen Proben, einschließlich formalinfixiertem Gewebe, durchgeführt werden, obwohl degradierte DNA und Umweltkontamination die Interpretation erschweren. Da die PCR DNA und nicht lebensfähige Zellen nachweist, werden die Ergebnisse zusammen mit Kultur-, Mikroskopie- und Antigenbefunden interpretiert.

Clinical relevance

Die molekulare Detektion und Sequenzierung bilden zunehmend die Grundlage dafür, wie Pilze identifiziert und einige Infektionen erkannt werden, und bestimmte PCR-Ergebnisse tragen zu Konsenskategorien der wahrscheinlichen invasiven Pilzerkrankung bei. Dieser Eintrag beschreibt die Methoden und ihre interpretativen Vorbehalte als Referenzmaterial und gibt keine Anweisungen zur Testung oder Patientenversorgung.

Evidence & guidelines

Konsensdefinitionen der EORTC/MSGERC integrieren spezifische PCR-Ergebnisse in die mykologischen Kriterien für eine wahrscheinliche invasive Pilzerkrankung, was die Reifung molekularer Methoden widerspiegelt, während Best-Practice-Empfehlungen ihren Platz neben Kultur- und Antigentests beschreiben. Der ITS-Sequenzierungsansatz geht auf die weit verbreiteten Primer zurück, die von White und Kollegen veröffentlicht wurden.

History

Nachdem die Polymerase-Kettenreaktion in den 1980er Jahren entwickelt wurde, schritt ihre Anwendung auf Pilze rasch voran, als White und Kollegen 1990 Primer zur Amplifikation und direkten Sequenzierung von ribosomalen Pilz-RNA-Genen veröffentlichten und die ITS-Region als phylogenetischen und später diagnostischen Marker etablierten. Real-Time PCR, breit-spektrale panfungale Assays und Hochdurchsatzsequenzierung erweiterten anschließend die molekulare Mykologie von der Forschung zur Routineidentifizierung und -detektion.

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

Was ist die ITS-Region und warum wird sie zur Identifizierung von Pilzen verwendet?

Der interne transkribierte Spacer (ITS) ist ein Teil des ribosomalen Pilz-Genclusters, der zwischen den Arten ausreichend variiert, während er von konservierten Sequenzen flankiert wird, was ihn zu einem praktischen universellen Barcode für die sequenzierungsbasierte Pilzidentifizierung macht.

Beweist eine positive Pilz-PCR eine aktive Infektion?

Nicht allein. Die PCR weist Pilz-DNA nach, die nach dem Verlust der Lebensfähigkeit von Organismen persistieren oder aus Kontaminationen stammen kann. Daher werden molekulare Ergebnisse zusammen mit Kultur, Mikroskopie und Antigentests sowie innerhalb standardisierter diagnostischer Definitionen interpretiert.