RNA-Sequenzierung und Transkriptomik

Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) bestimmt die Identität und Häufigkeit von RNA-Molekülen in einer Probe mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung und liefert ein quantitatives, genomweites Bild der Genexpression. Die Transkriptomik ist die Untersuchung dieser vollständigen Menge von Transkripten, dem Transkriptom, und wie es sich zwischen Geweben, Bedingungen und Krankheitszuständen verändert.

Definition

Die RNA-Sequenzierung ist eine Methode, die RNA in eine Bibliothek sequenzierter Fragmente umwandelt und auf Gene oder Transkripte abgebildete Reads zählt, um die Expression über das Transkriptom, die vollständige Menge der in einer Zelle oder einem Gewebe vorhandenen RNA-Moleküle, zu quantifizieren.

Scope

Dieses Thema behandelt, wie RNA-seq Sequenz-Reads in Expressionsschätzungen umwandelt, die Bedeutung des Transkriptoms als dynamische Auslese, gängige Quantifizierungseinheiten sowie die qualitäts- und standardisierungsbezogenen Probleme, die spezifisch für sequenzierungsbasierte Messungen sind. Es behandelt RNA-seq als Mess- und Entdeckungsplattform und nicht als klinisches Testprotokoll.

Core questions

• Wie werden Sequenz-Reads in quantitative Expressionsschätzungen umgewandelt?
• Was erfasst das Transkriptom über eine feste Genliste hinaus?
• Wie beeinflussen Normalisierung und Read-Tiefe die Vergleichbarkeit?
• Wie wird die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von RNA-seq bewertet?

Key concepts

• Transkriptom
• Read-Mapping und -Zählung
• Normalisierung (z.B. Tiefen- und Längenskalierung)
• Differentielle Expression
• Spike-in-Kontrollen
• Einzelzell- und Bulk-Transkriptomik

Mechanisms

RNA wird extrahiert, in cDNA reverse transkribiert, fragmentiert und zu einer Sequenzierungsbibliothek aufbereitet; die resultierenden Reads werden an ein Referenzgenom oder -transkriptom angeglichen, und die Anzahl der Reads, die sich mit jedem Merkmal überschneiden, liefert eine Zählung, die proportional zu seiner Expression ist (Mortazavi et al., 2008). Da die gesamte Read-Tiefe und die Transkriptlänge die Rohdaten beeinflussen, werden die Daten normalisiert, bevor Transkripte verglichen werden können, und die Abundanz wird häufig in längen- und tiefenskalierte Einheiten ausgedrückt. RNA-seq kann neue Transkripte, Spleißvarianten und einen weiten dynamischen Expressionsbereich erkennen, was es von früheren hybridisierungsbasierten Profilierungen unterscheidet (Wang et al., 2009). Externe Spike-in-Standards und Konsortium-Benchmarking werden verwendet, um die Genauigkeit und Grenzen der Plattform zu charakterisieren (Jiang et al., 2011; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Clinical relevance

RNA-seq ist zunehmend die Grundlage für die molekulare Tumorprofilierung, Fusionserkennung und expressionsbasierte Klassifizierung, und die Interpretation solcher Daten erfordert ein Verständnis, wie Zählungen zu Expressionsschätzungen werden. Dieser Eintrag beschreibt die Methode und ihre quantitativen Eigenschaften; er liefert keine diagnostischen Interpretationen oder Behandlungsleitlinien, die auf validierten Assays und klinischen Kriterien beruhen.

Evidence & guidelines

Grundlegende Beschreibungen der RNA-seq als quantitative Methode (Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009) werden durch gemeinschaftliche Bemühungen zur Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ergänzt, einschließlich externer Spike-in-Standards (Jiang et al., 2011) und des SEQC/MAQC-III-Benchmarking der RNA-seq-Leistung (2014).

History

Die Transkriptom-Messung verlagerte sich in den späten 2000er Jahren von Expressed-Sequence-Tag- und Microarray-Ansätzen zur direkten Sequenzierung, als die Next-Generation-Sequenzierung das Abzählen von Reads des gesamten Transkriptoms praktikabel machte (Mortazavi et al., 2008). RNA-seq wurde schnell zu einem Standard für Expressionsstudien, und nachfolgende Konsortiumsarbeiten befassten sich damit, wie ihre Messungen vergleichbar und reproduzierbar gemacht werden können (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Debates

Wie sollten RNA-seq-Zählungen für den Vergleich normalisiert werden?

Rohdaten hängen von der Sequenziertiefe und der Transkriptlänge ab, und unterschiedliche Normalisierungsentscheidungen können ändern, welche Gene differentiell exprimiert erscheinen; die Auswahl geeigneter Normalisierung und Kontrollen bleibt ein methodisches Anliegen.

Key figures

• Zhong Wang
• Michael Snyder
• Ali Mortazavi
• Barbara Wold

Seminal works

• wang-2009
• mortazavi-2008
• seqc-2014

Frequently asked questions

Was ist das Transkriptom?

Das Transkriptom ist die vollständige Menge der RNA-Transkripte, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden sind; da es sich mit dem Zustand und dem Zelltyp ändert, zeigt seine Messung, welche Gene aktiv sind und in welchem Ausmaß.

Wie unterscheidet sich RNA-seq von Microarrays für die Expression?

RNA-seq sequenziert und zählt RNA direkt, sodass es neue Transkripte und Spleißvarianten erkennen kann und einen weiten dynamischen Bereich abdeckt, während Microarrays die Hybridisierung an vordefinierte Sonden messen und auf bekannte Sequenzen beschränkt sind.