DNA- und RNA-Sequenzierungsmethoden

Sequenzierungsmethoden bestimmen die präzise Reihenfolge der Nukleotide in der DNA oder, nach Umwandlung, in der RNA. Von Sangers Kettenabbruchchemie bis hin zu massiv parallelen Next-Generation-Plattformen ermöglichen diese Techniken der molekularen Pathologie, Gene Basen für Basen zu lesen, Mutationen zu detektieren und die Genexpression in großem Maßstab zu profilieren.

Definition

DNA- und RNA-Sequenzierungsmethoden sind Labortechniken, die die lineare Reihenfolge der Nukleotidbasen in einem Nukleinsäuremolekül ablesen; RNA wird typischerweise vor der Sequenzierung in komplementäre DNA reverse transkribiert.

Scope

Das Thema umfasst die Sequenzierung der ersten Generation (Sanger), die Sequenzierung der nächsten Generation (massiv parallel) und die RNA-Sequenzierung zur Transkriptomanalyse, zusammen mit dem allgemeinen Arbeitsablauf der Bibliothekspräparation, Sequenzierung und Read-Alignment. Es wird als methodisches Referenzmaterial und nicht als Leitfaden für klinische Tests präsentiert.

Key concepts

• Kettenabbruch- (Sanger-) Sequenzierung
• Next-Generation- / massiv parallele Sequenzierung
• Bibliothekspräparation
• Sequenzierungs-Reads und -Abdeckung
• Read-Alignment und Variantenidentifikation
• RNA-Sequenzierung (Transkriptomik)
• Gezielte Sequenzierung, Exom- und Gesamtgenomsequenzierung

Mechanisms

Die Sanger-Sequenzierung integriert kettenabbbrechende Didesoxynukleotide, um Fragmente jeder Länge zu erzeugen, die nach Größe getrennt werden, um die Sequenz zu rekonstruieren (Sanger et al., 1977). Die Next-Generation-Sequenzierung hingegen bereitet eine Bibliothek fragmentierter DNA vor, amplifiziert diese räumlich und sequenziert Millionen von Fragmenten parallel, wobei kurze Abschnitte gelesen werden, deren Signale rechnerisch zusammengesetzt werden (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). Die RNA-Sequenzierung wendet denselben parallelen Ansatz auf komplementäre DNA an, die aus RNA gewonnen wird, quantifiziert Transkripte und offenbart Spleiß- und Expressionsmuster (Wang et al., 2009). Reads werden an eine Referenz angeglichen, um Varianten zu identifizieren oder die Abundanz zu messen.

Clinical relevance

Die Sequenzierung unterstützt die Detektion krankheitsassoziierter Varianten und die molekulare Charakterisierung von Tumoren und Pathogenen. Dieser Eintrag erklärt, wie die Methoden Sequenzdaten generieren, und ist als Referenz gedacht; er berät nicht bei der Auswahl, Interpretation oder dem Handeln auf der Grundlage von Sequenzierungstests in der individuellen Patientenversorgung.

Evidence & guidelines

Die Methoden basieren auf einer grundlegenden Primärliteratur, von Sangers Kettenabbruchmethode von 1977 über die erste Hochdurchsatz-Pikoliter-Plattform (Margulies et al., 2005) und die Sequenz des menschlichen Genoms (Venter et al., 2001), mit späteren Übersichten, die ein Jahrzehnt der Next-Generation-Technologien und den Aufstieg von RNA-Seq (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009) beleuchten.

History

Sangers Kettenabbruchmethode (1977) machte die DNA-Sequenzierung routinemäßig und bildete die Grundlage für die erste Sequenzierung des menschlichen Genoms (Venter et al., 2001). Die Einführung der massiv parallelen Sequenzierung Mitte der 2000er Jahre senkte die Kosten drastisch und erhöhte den Durchsatz (Margulies et al., 2005), und innerhalb eines Jahrzehnts waren Next-Generation-Sequenzierung und RNA-Seq zu Standardwerkzeugen für Genomik und Transkriptomik geworden (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

Wie unterscheidet sich die Next-Generation-Sequenzierung von der Sanger-Sequenzierung?

Die Sanger-Sequenzierung liest ein DNA-Fragment nach dem anderen mittels Kettenabbruchchemie, während die Next-Generation-Sequenzierung Millionen von Fragmenten gleichzeitig auf massiv parallele Weise liest, was den Durchsatz erheblich erhöht und die Kosten pro Base senkt.

Kann RNA direkt sequenziert werden?

RNA wird üblicherweise zuerst durch Reverse Transkription in komplementäre DNA umgewandelt und dann sequenziert; dieser RNA-Seq-Ansatz quantifiziert Transkripte und offenbart Spleiß- und Expressionsmuster.