Next-Generation-Sequenzierungstechnologien

Next-Generation-Sequenzierung (NGS), auch als Hochdurchsatz- oder massiv-parallele Sequenzierung bezeichnet, bezieht sich auf Plattformen, die Millionen bis Milliarden von DNA-Fragmenten gleichzeitig lesen und damit die Sanger-Methode, bei der jeweils nur ein Read erzeugt wird, ablösen. Diese Technologien haben die Kosten der Sequenzierung um Größenordnungen gesenkt und Studien des gesamten Genoms, Exoms und Transkriptoms routinemäßig gemacht.

Definition

Next-Generation-Sequenzierungstechnologien sind Plattformen, die die Nukleotidsequenz bestimmen, indem sie eine sehr große Anzahl von DNA-Fragmenten parallel lesen und so Hochdurchsatzdaten zu geringen Kosten pro Base erzeugen, im Gegensatz zum sequenziellen elektrophoretischen Lesen der Sanger-Sequenzierung.

Scope

Der Eintrag gibt einen Überblick über die Familien von Hochdurchsatz-Plattformen, einschließlich der Kurz-Read-Sequenzierung durch Synthese und der Lang-Read-Einzelmolekül-Ansätze wie Nanoporen- und Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung, die sie unterscheidenden Kompromisse zwischen Read-Länge und Genauigkeit sowie deren Auswirkungen auf den Umfang der Genomik. Es handelt sich um eine methodische Übersicht, nicht um einen Vergleich für Kauf- oder klinische Testentscheidungen.

Core questions

• Was unterscheidet die Next-Generation-Sequenzierung von der früheren Sanger-Sequenzierung?
• Wie unterscheiden sich Kurz-Read- und Lang-Read-Plattformen in Bezug auf Read-Länge, Genauigkeit und Anwendungen?
• Wie hat die Hochdurchsatzsequenzierung den Umfang und die Kosten der Genomik verändert?

Key concepts

• Massiv-parallele Sequenzierung
• Sequenzierung durch Synthese
• Kurz-Read- versus Lang-Read-Plattformen
• Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung
• Nanoporensequenzierung
• Kompromiss zwischen Read-Länge und Genauigkeit pro Base
• Kosten pro Base

Mechanisms

Hochdurchsatz-Plattformen immobilisieren und lesen enorme Mengen von DNA-Fragmenten gleichzeitig. Die Kurz-Read-Sequenzierung durch Synthese detektiert jede Base, während sie eingebaut wird, oft unter Verwendung reversibler Terminatoren, was kurze, aber hochgenaue Reads liefert. Lang-Read-Ansätze lesen Einzelmoleküle in Echtzeit oder während sie eine Nanopore passieren, wodurch wesentlich längere Reads erzeugt werden, die repetitive und strukturell komplexe Regionen abdecken, allerdings auf Kosten einer etwas höheren Fehlerrate pro Base. Die Wahl zwischen den Plattformen spiegelt einen Kompromiss zwischen Read-Länge, Genauigkeit, Durchsatz und Kosten wider, der vom analytischen Ziel abhängt.

Clinical relevance

Die Next-Generation-Sequenzierung ist das Arbeitspferd der modernen Genomforschung und klinischen Genomik und ermöglicht alles von der Variantenentdeckung bis zur Pathogen- und Krebsgenomik. Dieser Eintrag beschreibt die Technologien und ihre Kompromisse als Referenzmaterial und empfiehlt keine bestimmte Plattform oder keinen bestimmten Test für den individuellen Gebrauch.

Evidence & guidelines

Das Feld ist durch einflussreiche Übersichtsartikel dokumentiert, die die Entwicklung der Plattformen nachzeichnen: Metzker (2010), Reuter et al. (2015) und Goodwin et al. (2016) für das breite Spektrum, und Wang et al. (2021) speziell für die Nanoporensequenzierung; Bentley et al. (2008) ist ein grundlegender Primärbericht zur Kurz-Read-Sequenzierung.

History

Nachdem die Sanger-Sequenzierung drei Jahrzehnte lang dominierte, kamen Mitte der 2000er Jahre kommerzielle massiv-parallele Plattformen auf den Markt, wobei die Kurz-Read-Sequenzierung mit reversiblen Terminatoren 2008 im Genom-Maßstab demonstriert wurde. Im folgenden Jahrzehnt stiegen der Durchsatz und die Kosten sanken drastisch, während Einzelmolekül-Lang-Read-Plattformen (Einzelmolekül-Echtzeit- und Nanoporensequenzierung) reiften, um die Read-Längenbeschränkungen von Kurz-Reads zu überwinden.

Key figures

• Michael Metzker
• Michael Snyder
• W. Richard McCombie
• David Bentley

Seminal works

• metzker-2009
• goodwin-2016
• wang-2021

Frequently asked questions

Welchen Mehrwert bietet die Next-Generation-Sequenzierung gegenüber der Sanger-Sequenzierung?

Sie liest Millionen bis Milliarden von Fragmenten parallel statt einzeln, wodurch der Durchsatz um viele Größenordnungen erhöht und die Kosten gesenkt werden, was Genom- und populationsweite Studien praktikabel macht.

Was ist der Hauptkompromiss zwischen Kurz-Read- und Lang-Read-Sequenzierung?

Kurze Reads sind typischerweise hochgenau, aber zu kurz, um lange Wiederholungen zu überbrücken, während lange Reads repetitive und strukturell komplexe Regionen abdecken, aber historisch höhere Fehlerraten pro Base aufwiesen.