تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتقنيات تضخيم الحمض النووي

تعمل تقنيات تضخيم الحمض النووي على نسخ تسلسل مختار من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) أو الحمض النووي الريبوزي (RNA) عدة مرات، بحيث يصبح الهدف الموجود بكميات ضئيلة قابلاً للكشف والقياس. يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) النموذج الأولي لهذه التقنيات: فمن خلال دورات متكررة من نزع الطبيعة، وربط البادئ (primer annealing)، وتمديد البوليميراز، ينتج عنه زيادة أسية في تسلسل محدد، مما يجعله حجر الزاوية في التشخيصات الجزيئية.

Definition

تقنيات تضخيم الحمض النووي هي طرق مخبرية (in vitro) تُنتج إنزيميًا العديد من النسخ لتسلسل محدد من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) أو الحمض النووي الريبوزي (RNA)، حيث يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الدورات الحرارية وبوليميراز الحمض النووي لتضخيم منطقة محددة بواسطة بادئين (primers).

Scope

يغطي هذا الموضوع تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (end-point PCR)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (الكمي)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي لأهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA)، والبدائل متساوية الحرارة مثل التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة (loop-mediated isothermal amplification). ويتناول المبادئ والمكونات واعتبارات الإبلاغ عن التضخيم كمرجع منهجي، وليس كبروتوكولات فحص أو إرشادات سريرية.

Key concepts

• الدورة الحرارية (نزع الطبيعة، الربط، التمديد)
• البادئات وبوليميراز الحمض النووي
• التضخيم الأسي
• تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي لأهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA)
• تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (الكمي)
• التضخيم المتساوي الحرارة (مثل LAMP)
• التحكم في التلوث والإيجابيات الكاذبة

Mechanisms

في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتم نزع طبيعة الحمض النووي المزدوج السلسلة حرارياً إلى سلاسل مفردة، ثم ترتبط البادئات القليلة النوكليوتيدات القصيرة بتسلسلات تحيط بالهدف، ويقوم بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة بتمديد البادئات لتخليق سلاسل تكميلية جديدة؛ وتكرار الدورة يضاعف الهدف في كل جولة، مما يؤدي إلى تضخيم أسي (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). يتم تحويل أهداف الحمض النووي الريبوزي (RNA) أولاً إلى حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين تكميلي بواسطة الناسخ العكسي (reverse transcriptase) قبل التضخيم. يراقب تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي تراكم المنتج دورة بعد دورة باستخدام كواشف فلورية، مما يتيح التقدير الكمي (Heid et al., 1996). تقوم الطرق متساوية الحرارة مثل التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة بالتضخيم عند درجة حرارة واحدة، متجنبة الحاجة إلى الدورات الحرارية (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

تُستخدم تقنيات التضخيم على نطاق واسع للكشف عن مسببات الأمراض وتوصيف الأهداف الجينية في المختبرات التشخيصية. يصف هذا المدخل كيفية عمل التضخيم وكيفية الإبلاغ عن أدائه؛ وهو مرجع منهجي ولا يقدم إرشادات لطلب أو تفسير أي اختبار معين في رعاية المرضى.

Evidence & guidelines

تحدد إرشادات MIQE (Bustin et al., 2009) الحد الأدنى من المعلومات اللازمة للإبلاغ عن تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي، وهي مرجع يُستشهد به على نطاق واسع للشفافية وقابلية التكرار. تصف الدراسات الأولية التأسيسية طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل الأصلية والتقدير الكمي في الوقت الفعلي (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996)، بينما قدمت أعمال لاحقة بدائل متساوية الحرارة (Notomi et al., 2000).

History

صاغ كاري موليس فكرة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وطُبقت لأول مرة على مشكلة تشخيصية — الكشف عن طفرة الخلايا المنجلية — بواسطة سايكي وزملاؤه في عام 1985، مع وصف الطريقة رسميًا في عام 1986 (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). أدى إدخال بوليميرازات مقاومة للحرارة إلى أتمتة العملية، وأضاف الكشف في الوقت الفعلي في التسعينيات قدرة كمية (Heid et al., 1996). وسعت التقنيات متساوية الحرارة لاحقًا التضخيم إلى البيئات التي لا تحتوي على أجهزة تدوير حراري (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

لماذا يضخم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الهدف بشكل أسي؟

تنسخ كل دورة كل سلسلة موجودة من الهدف، لذا يتضاعف عدد النسخ تقريبًا في كل جولة؛ وبعد عدة دورات، يمكن أن يصل التسلسل الذي بدأ ببضع جزيئات إلى مليارات النسخ.

كيف يختلف التضخيم المتساوي الحرارة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟

تضخم الطرق متساوية الحرارة مثل التضخيم المتساوي الحرارة بوساطة الحلقة الحمض النووي عند درجة حرارة ثابتة واحدة باستخدام بادئات وإنزيمات متخصصة، مما يلغي الحاجة إلى دورات التسخين والتبريد المتكررة التي يتطلبها تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي.