التشخيص الجزيئي: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتسلسل

تكتشف الطرق الجزيئية الفطريات وتحددها من خلال أحماضها النووية بدلاً من نموها أو مظهرها. يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل على تضخيم الحمض النووي الفطري من العينات أو العزلات، ويقوم تسلسل المناطق المحفوظة، وخاصة الفاصل الداخلي المنسوخ (internal transcribed spacer) لمجموعة الجينات الريبوسومية، بقراءة الحمض النووي المضخم لتحديد الكائن الحي، وغالبًا ما يكون ذلك أسرع وأكثر دقة من المزرعة.

Definition

التشخيصات الجزيئية للفطريات هي تقنيات تضخم وتحلل الأحماض النووية الفطرية، باستخدام تفاعل البوليميراس المتسلسل (PCR) للكشف عن الحمض النووي الفطري وتسلسل الحمض النووي للمناطق المحفوظة مثل الفاصل الداخلي المنسوخ (internal transcribed spacer) لتحديد الكائن الحي على مستوى الجنس أو النوع.

Scope

يغطي هذا الموضوع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الخاص بالأنواع وواسع النطاق (panfungal)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (real-time PCR)، وتسلسل الحمض النووي لمناطق الترميز الشريطي (barcoding regions) مثل ITS، واستخدام هذه الطرق على عزلات المزرعة ومباشرة على المواد السريرية، بما في ذلك الأنسجة المثبتة بالفورمالين. ويصنفها كطرق تحديد وكشف ولا يقدم أي تعليمات للاختبار أو العلاج.

Core questions

• هل الحمض النووي الفطري موجود في هذه العينة، ومن أي كائن حي يأتي؟
• متى يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل الشامل للفطريات واسع النطاق مفضلاً على الفحص الخاص بالأنواع؟
• ما هي المنطقة الجينومية التي تميز الفطريات محل الاهتمام بشكل أفضل؟
• كيف تُفسر النتائج الجزيئية بالنظر إلى مخاطر التلوث واكتشاف الحمض النووي غير القابل للحياة؟

Key concepts

• تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
• تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأنواع مقابل واسع النطاق (panfungal)
• تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (الكمي)
• الفاصل الداخلي المنسوخ (ITS) كرمز شريطي فطري
• تسلسل الحمض النووي وقواعد البيانات المرجعية
• الكشف على العزلات مقابل الكشف المباشر على الأنسجة
• التحكم في التلوث وتفسير الحمض النووي الخالي من الخلايا

Mechanisms

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) البادئات (primers) وبوليميراز مستقر حرارياً لتضخيم الحمض النووي المستهدف من خلال دورات متكررة، مما يولد ما يكفي من النسخ للكشف حتى عن كميات صغيرة من المادة الوراثية الفطرية. تستهدف الفحوصات الخاصة بالأنواع كائناً حياً معروفاً، بينما تستخدم الفحوصات واسعة النطاق أو الشاملة للفطريات (panfungal) بادئات ضد مناطق محفوظة مشتركة بين العديد من الفطريات، وبعد ذلك يكشف التسلسل عن الهوية. منطقة الفاصل الداخلي المنسوخ (internal transcribed spacer) لمجموعة جينات الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي، المحاطة ببادئات محفوظة وصفها وايت وزملاؤه، متغيرة بما يكفي بين الأنواع لتكون بمثابة رمز شريطي فطري عالمي، ويتم مطابقة تسلسل القراءة مع قواعد البيانات المرجعية لتحديد الكائن الحي. يضيف تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (real-time PCR) التحديد الكمي والسرعة، ويمكن إجراء الفحوصات على العزلات المزروعة أو مباشرة على العينات السريرية، بما في ذلك الأنسجة المثبتة بالفورمالين، على الرغم من أن الحمض النووي المتحلل والتلوث البيئي يعقدان التفسير. ولأن تفاعل البوليميراز المتسلسل يكشف الحمض النووي بدلاً من الخلايا الحية، تُقرأ النتائج جنباً إلى جنب مع المزرعة والمجهر ونتائج المستضدات.

Clinical relevance

يتزايد الاعتماد على الكشف الجزيئي والتسلسل في كيفية تحديد الفطريات وكيفية التعرف على بعض العدوى، وتساهم بعض نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل في فئات الإجماع لمرض الفطريات الغازية المحتمل. يصف هذا المدخل الطرق ومحاذير تفسيرها كمادة مرجعية ولا يوجه الاختبار أو رعاية المرضى.

Evidence & guidelines

تتضمن التعريفات المتفق عليها من EORTC/MSGERC نتائج محددة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ضمن المعايير الفطرية لمرض الفطريات الغازية المحتمل، مما يعكس نضج الطرق الجزيئية، بينما تصف توصيات أفضل الممارسات مكانها إلى جانب المزرعة واختبار المستضدات. يعود نهج تسلسل ITS إلى البادئات المستخدمة على نطاق واسع والتي نشرها وايت وزملاؤه.

History

بعد تطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل في الثمانينيات، تقدم تطبيقه على الفطريات بسرعة عندما نشر وايت وزملاؤه، في عام 1990، بادئات لتضخيم وتسلسل جينات الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي الفطري مباشرة، مما أرسى منطقة ITS كعلامة تطورية ثم تشخيصية. وقد وسعت تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، والفحوصات الشاملة للفطريات واسعة النطاق، والتسلسل عالي الإنتاجية، علم الفطريات الجزيئي من البحث إلى التحديد والكشف الروتيني.

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

ما هي منطقة ITS ولماذا تستخدم لتحديد الفطريات؟

الفاصل الداخلي المنسوخ (ITS) هو جزء من مجموعة الجينات الريبوسومية الفطرية التي تختلف بما يكفي بين الأنواع بينما تكون محاطة بتسلسلات محفوظة، مما يجعلها رمزًا شريطيًا عالميًا عمليًا لتحديد الفطريات القائم على التسلسل.

هل تثبت نتيجة PCR إيجابية للفطريات وجود عدوى نشطة؟

ليس بمفردها. يكشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عن الحمض النووي الفطري، والذي يمكن أن يستمر بعد أن تصبح الكائنات الحية غير قابلة للحياة أو ينشأ من التلوث، لذلك تُفسر النتائج الجزيئية جنبًا إلى جنب مع المزرعة والمجهر واختبارات المستضدات وضمن التعريفات التشخيصية الموحدة.