تفاعل البوليميراز المتسلسل وتضخيم الحمض النووي

تفاعل البوليميراز المتسلسل — وهي طريقة دورية موجهة بالبادئات تنسخ جزءًا مختارًا من الحمض النووي (DNA) بشكل مضاعف — والعائلة الأوسع من تقنيات التضخيم المبنية عليها.

Definition

تفاعل البوليميراز المتسلسل هو طريقة مخبرية (in vitro) تضخم منطقة محددة من الحمض النووي (DNA) بشكل مضاعف من خلال دورات متكررة من فصل السلاسل، وتلدين البادئات المحيطة، والاستطالة بواسطة بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة؛ ويشمل تضخيم الحمض النووي بشكل أوسع التقنيات ذات الصلة لنسخ تسلسلات الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبوزي (RNA).

Scope

يغطي هذا الموضوع مبادئ ومتغيرات تضخيم الحمض النووي: الدورة الحرارية المتمثلة في نزع الطبيعة، وتلدين البادئات، والاستطالة التي تحدد تفاعل البوليميراز المتسلسل؛ ودور البادئات والبوليميراز المقاوم للحرارة؛ والامتدادات مثل النسخ العكسي والتضخيم الكمي في الوقت الفعلي. يتناول الموضوع الطريقة ومنطقها؛ بينما يتم تغطية التسلسل والاستنساخ اللذين يستخدمان الحمض النووي المضخم في مواضيع مصاحبة.

Core questions

• كيف تضخم الدورات المتكررة من التسخين والتبريد منطقة معينة من الحمض النووي؟
• لماذا تعتبر بادئتان وبوليميراز مقاوم للحرارة ضرورية؟
• كيف يصبح التضخيم مضاعفًا؟
• كيف يتم توسيع الطريقة لتحديد كمية الأحماض النووية أو لتضخيم الحمض النووي الريبوزي؟

Key theories

التضخيم الأسي المحدد بالبادئات

يحدد زوج من البادئات المحيطة بالهدف المنطقة المضخمة، ولأن كل سلسلة جديدة تعمل كقالب في الدورة التالية، فإن عدد نسخ الهدف يتضاعف تقريبًا في كل دورة، وينمو بشكل مضاعف.

بوليميراز مقاوم للحرارة يتيح الدورة

يسمح استخدام بوليميراز الحمض النووي المستقر حرارياً بنزع الطبيعة المتكرر عند درجات حرارة عالية دون إعادة إضافة الإنزيم، مما يجعل الدورة الحرارية الآلية عملية والتفاعل قويًا.

Mechanisms

تقوم كل دورة بتسخين العينة لفصل سلسلتي الحمض النووي، ثم تبريدها بحيث تلتصق بادئتان بتسلسلات تحيط بالهدف على السلاسل المتقابلة، ثم تسخينها إلى درجة حرارة استطالة حيث يقوم بوليميراز مقاوم للحرارة بتخليق سلاسل جديدة من البادئات. ولأن نواتج دورة واحدة تعمل كقوالب للدورة التالية، يتم تضخيم المنطقة المستهدفة بشكل مضاعف على مدى العديد من الدورات. تشمل المتغيرات تضخيم النسخ العكسي، الذي ينسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) أولاً إلى حمض نووي (DNA)، والتضخيم الكمي في الوقت الفعلي، الذي يراقب تراكم المنتج لقياس الكميات الأولية.

Clinical relevance

يعد التضخيم محوريًا في الاختبارات الجينية، والكشف عن مسببات الأمراض، وتحديد الهوية الجنائية؛ ويُقدم كأهمية بدلاً من كونه إرشادات سريرية.

History

تصور موليس تفاعل البوليميراز المتسلسل في أوائل الثمانينيات، وأظهر تقرير سايكي وزملاؤه عام 1985 استخدامه، ومع الاعتماد اللاحق للبوليميراز المقاوم للحرارة أصبح روتينيًا؛ وقد تم الاعتراف بالاختراع بجائزة نوبل في الكيمياء عام 1993.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

لماذا يحتاج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى بادئات؟

تحدد البادئات نقاط البداية للتخليق على كل سلسلة، وبالتالي تحدد المنطقة التي يتم نسخها وتسمح للبوليميراز ببدء الاستطالة.

ما الذي يجعل التضخيم مضاعفًا؟

تصبح السلاسل الجديدة لكل دورة قوالب في الدورة التالية، وبالتالي يتضاعف عدد نسخ الهدف تقريبًا في كل دورة.