التشخيص الجزيئي: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR)، وتضخيم الحمض النووي

يكشف التشخيص الجزيئي عن الفيروس عن طريق تضخيم وتحديد حمضه النووي. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وبالنسبة لفيروسات الحمض النووي الريبوزي (RNA)، تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR)، بنسخ تسلسل جينومي مستهدف ملايين المرات بحيث تصبح حتى الكميات الصغيرة جدًا من الجينوم الفيروسي قابلة للكشف، مما يمنح هذه الطرق حساسية ونوعية عالية ويجعلها الدعامة الأساسية للتشخيص الفيروسي الحديث.

Definition

التشخيص الجزيئي هو الكشف، وعند الحاجة، التحديد الكمي للحمض النووي الفيروسي بواسطة تقنيات التضخيم مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR)، والطرق متساوية الحرارة، والتي تنسخ هدفًا جينوميًا محددًا إلى مستويات قابلة للكشف.

Scope

يغطي هذا الموضوع تقنيات تضخيم الحمض النووي المستخدمة في علم الفيروسات: تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي واللحظي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي لفيروسات الحمض النووي الريبوزي، والقياس الكمي للحمل الفيروسي، والبدائل متساوية الحرارة مثل التضخيم المعتمد على الحلقة. يشرح المبادئ والتفسير على مستوى مرجعي ولا يقدم بروتوكولات الفحص أو نصائح الإدارة السريرية.

Core questions

• كيف يجعل تضخيم تسلسل مستهدف الفيروس قابلاً للكشف من كمية أولية ضئيلة؟
• ما هي الخطوة الإضافية التي يتطلبها فيروس الحمض النووي الريبوزي مقارنة بفيروس الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين؟
• كيف يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي لتحديد الحمل الفيروسي، وماذا تعني عتبة الدورة؟
• متى تكون الأشكال متساوية الحرارة أو المتعددة أفضل من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي؟

Key concepts

• تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
• النسخ العكسي (RT-PCR)
• البادئات وخصوصية الهدف
• الدورة الحرارية والتضخيم الأسي
• تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي (الكمي)
• عتبة الدورة والحمل الفيروسي
• التضخيم المتعدد
• التضخيم متساوي الحرارة (مثل LAMP)

Mechanisms

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل بادئين قصيرين يحيطان بمنطقة مختارة من الجينوم الفيروسي، وبوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة، ودورات متكررة من التسخين والتبريد. تقوم كل دورة بمسخ الحمض النووي، وتثبيت البادئات، وتمديد خيوط جديدة، مما يضاعف الهدف بحيث يتراكم بشكل أسي. بالنسبة لفيروسات الحمض النووي الريبوزي، تقوم خطوة النسخ العكسي أولاً بتحويل جينوم الحمض النووي الريبوزي إلى حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين مكمل قبل التضخيم. يراقب تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي تراكم المنتج دورة بعد دورة باستخدام كواشف فلورية، مما يسمح بالقياس الكمي: يرتبط عتبة الدورة التي ترتفع عندها الإشارة فوق الخلفية عكسياً بكمية القالب البدائي، مما يعطي تقديرًا للحمل الفيروسي. تقوم التصميمات المتعددة بتضخيم عدة أهداف في وقت واحد، وتحقق الطرق متساوية الحرارة مثل التضخيم المعتمد على الحلقة التضخيم عند درجة حرارة ثابتة، مما يقلل من متطلبات الأجهزة للاختبار اللامركزي.

Clinical relevance

يوفر تضخيم الحمض النووي كشفًا حساسًا ونوعيًا للعدوى الفيروسية النشطة ويدعم مراقبة الحمل الفيروسي المستخدمة لمتابعة العدوى والاستجابة للعلاج. يصف هذا المدخل كيفية عمل الطرق وكيفية تفسير النتائج مثل عتبة الدورة من حيث المبدأ، بما في ذلك نقطة أن الكشف عن الجينوم لا يثبت بحد ذاته وجود فيروس معدي؛ وهو وصفي للمنهجية وليس أساسًا لقرارات التشخيص أو العلاج الفردية.

Epidemiology

أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي للنسخ العكسي (RT-PCR) الطريقة المرجعية لتأكيد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2، وقد أتاح النشر السريع للفحوصات المعتمدة في أوائل عام 2020 توسيع نطاق الاختبار الجزيئي عالميًا، مما يوضح كيف يدعم تضخيم الحمض النووي الكشف عن الأوبئة والمراقبة.

History

تم تصور تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة كاري موليس وطُبق لأول مرة على التشخيص الجيني بواسطة سايكي وزملاؤه في عام 1985، وتم إضفاء الطابع الرسمي على الطريقة بواسطة موليس وفالونا في عام 1987. أضاف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي اللحظي، الذي وصفه هايد وزملاؤه في عام 1996، قياسًا كميًا مستمرًا، ووسعت الطرق متساوية الحرارة مثل التضخيم المعتمد على الحلقة، التي قدمها نوتومي وزملاؤه في عام 2000، نطاق الأماكن التي يمكن فيها إجراء التضخيم.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

ما الفرق بين تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR)؟

يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بتضخيم الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)، لذلك يُستخدم مباشرة لفيروسات الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين. يضيف تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) خطوة نسخ عكسي تحول جينوم الحمض النووي الريبوزي (RNA) للفيروس إلى حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين مكمل أولاً، مما يسمح بالكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبوزي مثل الإنفلونزا والفيروسات التاجية.

هل تعني نتيجة تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية وجود فيروس معدي؟

ليس بالضرورة. يكشف تفاعل البوليميراز المتسلسل عن الجينوم الفيروسي، والذي يمكن أن يستمر بعد أن يتوقف الفيروس عن التكاثر أو يكون غير معدي. يتطلب إثبات وجود فيروس معدي زراعة أو فحوصات وظيفية أخرى تُفسر في السياق السريري.