طرق تسلسل الحمض النووي (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA)

تحدد طرق التسلسل الترتيب الدقيق للنيوكليوتيدات في الحمض النووي (DNA) أو، بعد التحويل، في الحمض النووي الريبوزي (RNA). من كيمياء إنهاء السلسلة لسنجر إلى منصات الجيل التالي المتوازية على نطاق واسع، تتيح هذه التقنيات لعلم الأمراض الجزيئي قراءة الجينات قاعدة تلو الأخرى، واكتشاف الطفرات، وتحديد أنماط التعبير الجيني على نطاق واسع.

Definition

طرق تسلسل الحمض النووي (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA) هي تقنيات مخبرية تقرأ الترتيب الخطي للقواعد النيوكليوتيدية في جزيء الحمض النووي؛ وعادةً ما يتم نسخ الحمض النووي الريبوزي عكسياً إلى حمض نووي مكمل (cDNA) قبل التسلسل.

Scope

يغطي هذا الموضوع تسلسل الجيل الأول (سنجر)، وتسلسل الجيل التالي (المتوازي على نطاق واسع)، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) لتحليل النسخ الجيني (transcriptome)، بالإضافة إلى سير العمل العام لإعداد المكتبة، والتسلسل، ومحاذاة القراءات. ويُقدم هذا الموضوع كمادة مرجعية منهجية بدلاً من كونه إرشادات للاختبارات السريرية.

Key concepts

• تسلسل إنهاء السلسلة (سنجر)
• تسلسل الجيل التالي / المتوازي على نطاق واسع
• إعداد المكتبة
• قراءات التسلسل والتغطية
• محاذاة القراءات وتحديد المتغيرات
• تسلسل الحمض النووي الريبوزي (علم النسخ الجيني)
• تسلسل مستهدف، تسلسل الإكسوم، وتسلسل الجينوم الكامل

Mechanisms

يُدمج تسلسل سنجر ثنائيات ديوكسي نيوكليوتيدات (dideoxynucleotides) التي تنهي السلسلة لتوليد شظايا من كل طول، والتي تُفصل حسب الحجم لإعادة بناء التسلسل (Sanger et al., 1977). بدلاً من ذلك، يقوم تسلسل الجيل التالي بإعداد مكتبة من الحمض النووي المجزأ، وتضخيمه مكانياً، وتسلسل ملايين الشظايا بالتوازي، وقراءة امتدادات قصيرة تُجمع إشاراتها حسابياً (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). يطبق تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) نفس النهج المتوازي على الحمض النووي المكمل المشتق من الحمض النووي الريبوزي، مع تحديد كمية النسخ والكشف عن أنماط التضفير والتعبير (Wang et al., 2009). تُحاذى القراءات مع مرجع لتحديد المتغيرات أو قياس الوفرة.

Clinical relevance

يدعم التسلسل اكتشاف المتغيرات المرتبطة بالأمراض والتوصيف الجزيئي للأورام ومسببات الأمراض. يشرح هذا المدخل كيف تولد الطرق بيانات التسلسل ويُقصد به أن يكون مرجعاً؛ ولا يقدم نصائح حول اختيار أو تفسير أو اتخاذ إجراءات بناءً على اختبارات التسلسل في رعاية المرضى الفردية.

Evidence & guidelines

تستند هذه الطرق إلى أدبيات أساسية تأسيسية، بدءاً من طريقة إنهاء السلسلة لسنجر عام 1977 وصولاً إلى أول منصة عالية الإنتاجية بحجم البيكولتر (Margulies et al., 2005) وتسلسل الجينوم البشري (Venter et al., 2001)، مع مراجعات لاحقة تستعرض عقداً من تقنيات الجيل التالي وصعود تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq) (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

History

جعلت طريقة إنهاء السلسلة لسنجر (1977) تسلسل الحمض النووي أمراً روتينياً وأسست لأول تسلسل للجينوم البشري (Venter et al., 2001). أدى إدخال التسلسل المتوازي على نطاق واسع في منتصف العقد الأول من القرن الحادي والعشرين إلى خفض التكلفة بشكل كبير وزيادة الإنتاجية (Margulies et al., 2005)، وفي غضون عقد من الزمن، أصبح تسلسل الجيل التالي وتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq) أدوات قياسية لعلم الجينوم وعلم النسخ الجيني (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

كيف يختلف تسلسل الجيل التالي عن تسلسل سنجر؟

يقرأ تسلسل سنجر جزءاً واحداً من الحمض النووي في كل مرة باستخدام كيمياء إنهاء السلسلة، بينما يقرأ تسلسل الجيل التالي ملايين الأجزاء في وقت واحد بطريقة متوازية على نطاق واسع، مما يزيد الإنتاجية بشكل كبير ويخفض التكلفة لكل قاعدة.

هل يمكن تسلسل الحمض النووي الريبوزي مباشرة؟

عادةً ما يتم تحويل الحمض النووي الريبوزي أولاً إلى حمض نووي مكمل عن طريق النسخ العكسي ثم يتم تسلسله؛ يحدد هذا النهج (RNA-Seq) كمية النسخ ويكشف عن أنماط التضفير والتعبير.