تقنيات التشخيص الجزيئي

تكتشف تقنيات التشخيص الجزيئي الطفيليات عن طريق تضخيم وتحديد أحماضها النووية، مما يوفر حساسية تحليلية عالية والقدرة على تمييز الأنواع والأنماط الجينية والعدوى المختلطة التي قد تفوتها الفحوصات المجهرية والمصلية. في علم الطفيليات، تتراوح هذه الطرق من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي واللحظي إلى صيغ التضخيم المتساوي الحرارة المصممة للاستخدام في نقاط الرعاية في الأماكن محدودة الموارد.

Definition

تقنيات التشخيص الجزيئي في علم الطفيليات هي طرق مخبرية تكتشف وتصف الطفيليات عن طريق تضخيم وتحديد تسلسلات الحمض النووي الخاصة بالطفيلي، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وكيمياء التضخيم ذات الصلة لتأكيد العدوى، وتصنيف الأنواع، والكشف عن العدوى منخفضة الكثافة أو المختلطة.

Scope

يغطي هذا الموضوع الكشف المعتمد على الحمض النووي في علم الطفيليات: تفاعل البوليميراز المتسلسل ومتغيراته اللحظية والمتداخلة، والطرق المتساوية الحرارة مثل التضخيم المتساوي الحرارة المعتمد على الحلقة (LAMP)، واستخدام هذه الأدوات لتصنيف الأنواع، والكشف عن الكثافة المنخفضة، وتحديد العدوى المختلطة أو الخفية. يتعامل هذا الموضوع مع الكشف الجزيئي كمنهجية تشخيصية ولا يقدم بروتوكولات اختبار سريري أو علاج. للتشخيص الجزيئي في سياق علم البكتيريا، انظر العقدة ذات الصلة.

Core questions

• كيف يحقق تضخيم الحمض النووي حساسية تتجاوز الفحص المجهري واختبارات المستضدات؟
• متى يغير تصنيف الأنواع والأنماط الجينية الاستنتاج التشخيصي أو الوبائي؟
• ما الذي يجعل الطرق المتساوية الحرارة مثل LAMP مناسبة للاستخدام في نقاط الرعاية وفي الميدان؟
• كيف يجب تفسير الكشف عن الحمض النووي للطفيلي بالنسبة للعدوى النشطة القابلة للحياة؟

Key concepts

• تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
• تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل واللحظي (الكمي)
• التضخيم المتساوي الحرارة المعتمد على الحلقة (LAMP)
• تصنيف الأنواع والأنماط الجينية
• الكشف عن العدوى المختلطة ومنخفضة الكثافة
• الحساسية والنوعية التحليلية
• الكشف عن الحمض النووي مقابل قابلية الكائن الحي للحياة

Mechanisms

تستغل هذه الطرق التعرف الخاص بالتسلسل على الحمض النووي للطفيلي. في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يقوم بوليميراز مقاوم للحرارة وبادئات تحيط بتسلسل مستهدف بدفع التضخيم الأسي من خلال دورات متكررة من التفكيك، والارتباط، والاستطالة، بحيث يمكن الكشف عن عدد قليل جدًا من النسخ الأولية؛ يضيف تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (nested PCR) زوجًا ثانيًا من البادئات لزيادة الحساسية والنوعية، ويقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي (real-time PCR) بقياس التضخيم أثناء تقدمه. تحقق الطرق المتساوية الحرارة مثل LAMP التضخيم عند درجة حرارة واحدة باستخدام بادئات متعددة وبوليميراز مزيح للشريط، مما يلغي الحاجة إلى الدورات الحرارية ويمكّن من استخدام صيغ أبسط قابلة للنشر في الميدان. نظرًا لأن التضخيم يستهدف الحمض النووي بدلاً من الكائن الحي القابل للحياة، يجب تفسير النتيجة الإيجابية مع التحذير من أن الحمض النووي المتبقي قد يستمر بعد أن لا يكون الطفيلي حيًا.

Clinical relevance

تعمل التقنيات الجزيئية على تحسين الكشف عن العدوى منخفضة الكثافة والمختلطة وتمكن من تحديد الأنواع والأنماط الجينية التي توجه المراقبة وتوصيف الحالات. يصف هذا المدخل الطرق وحدودها التفسيرية كدليل وليس بديلاً عن بروتوكولات المختبر أو اتخاذ القرارات السريرية.

Epidemiology

من خلال الكشف عن العدوى تحت العتبة المجهرية وحل خليط الأنواع، قامت الطرق الجزيئية بمراجعة تقديرات حمل الطفيليات تحت المجهرية في الملاريا والعدوى الأخرى، مما أثر على نماذج الانتقال وتقييم برامج المكافحة؛ ويتم استكشاف الصيغ المتساوية الحرارة بشكل متزايد للاختبار اللامركزي في الأماكن الموبوءة ومحدودة الموارد.

History

أدى إدخال تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بوليميراز مقاوم للحرارة من قبل سايكي وزملاؤه في عام 1988 إلى جعل تضخيم الحمض النووي الروتيني عمليًا وتم تكييفه للطفيليات بعد ذلك بوقت قصير، مع زيادة فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (nested PCR) بشكل كبير لحساسية الكشف عن الملاريا بحلول أوائل التسعينيات. فتح وصف التضخيم المتساوي الحرارة المعتمد على الحلقة (LAMP) في عام 2000 مسارًا للتشخيصات الجزيئية الخفيفة المعدات في نقاط الرعاية والتي لا تزال قيد التطوير للأمراض الطفيلية.

Debates

هل يثبت الكشف عن الحمض النووي للطفيلي وجود عدوى نشطة؟

يؤكد التضخيم وجود الحمض النووي للطفيلي ولكنه لا يستطيع بمفرده إثبات وجود كائن حي قابل للحياة، حيث يمكن أن يستمر الحمض النووي المتبقي بعد التخلص من العدوى؛ وهذا يعقد استخدام الإيجابية الجزيئية كاختبار للشفاء.

Seminal works

• saiki-1988
• notomi-2000
• snounou-1993

Frequently asked questions

لماذا غالبًا ما تكون الاختبارات الجزيئية أكثر حساسية من الفحص المجهري؟

يمكن للتضخيم أن يضاعف بضع نسخ من الحمض النووي للطفيلي إلى إشارة قابلة للكشف، لذلك يمكن الكشف عن العدوى ذات الكثافة الطفيلية المنخفضة جدًا التي قد يفوتها الفحص المجهري وتحديد نوعها.

ما الميزة التي يقدمها LAMP على تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي؟

يضخم LAMP الحمض النووي عند درجة حرارة ثابتة واحدة دون الحاجة إلى جهاز دورة حرارية، مما يجعله أبسط وأسرع وأكثر ملاءمة للاستخدام في نقاط الرعاية وفي الميدان، على الرغم من أن تصميم الفحص وتفسيره لا يزال يتطلب عناية.