التحليل الكمي في الوقت الفعلي وتقييم عدد النسخ

تقيس الطرق الجزيئية الكمية كمية الحمض النووي المستهدف الموجود، بدلاً من مجرد تحديد ما إذا كان قابلاً للكشف. يتتبع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي التضخيم فور حدوثه، ويقسم تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي العينة لعد الجزيئات بشكل مطلق، ويحدد تقييم عدد النسخ ما إذا كانت منطقة جينومية قد اكتسبت أو فقدت.

Definition

يقيس التحليل الكمي في الوقت الفعلي كمية الحمض النووي المستهدف، عادةً عن طريق مراقبة الإشارة الفلورية أثناء التضخيم (تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي) أو عن طريق عد الأقسام الإيجابية (تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي)؛ ويحدد تقييم عدد النسخ عدد نسخ منطقة جينومية بالنسبة إلى مرجع.

Scope

يغطي هذا الموضوع تفاعل البوليميراز المتسلسل (الكمي) في الوقت الفعلي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي والرقمي القطيري، والمناهج المتبعة لتقييم عدد النسخ. ويتناول مبادئ التقدير الكمي والاعتبارات التي تجعل النتائج قابلة للمقارنة، ويُقدم كمادة مرجعية منهجية بدلاً من كونه إرشادات للاختبارات السريرية.

Key concepts

• تفاعل البوليميراز المتسلسل (الكمي) في الوقت الفعلي
• دورة التقدير الكمي (Cq) وكفاءة التضخيم
• المنحنيات القياسية والتقدير الكمي النسبي
• تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي والرقمي القطيري
• التقدير الكمي المطلق عن طريق التقسيم
• اكتساب وفقدان عدد النسخ
• معايير الإبلاغ وقابلية التكرار

Mechanisms

يربط تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي التضخيم بمراسل فلوري ترتفع إشارته بما يتناسب مع تراكم المنتج؛ وتعكس الدورة التي تتجاوز عندها الإشارة عتبة معينة الكمية الأولية للمادة المستهدفة، مما يسمح بالتقدير الكمي النسبي أو باستخدام منحنى قياسي (Heid et al., 1996). بدلاً من ذلك، يوزع تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي العينة إلى العديد من الأقسام الصغيرة بحيث يحتوي كل منها على صفر أو عدد قليل من الجزيئات؛ ويؤدي عد نسبة الأقسام الإيجابية وتطبيق إحصائيات بواسون إلى عد مطلق دون الحاجة إلى منحنى قياسي (Hindson et al., 2011). يقارن تقييم عدد النسخ وفرة المنطقة المستهدفة بمرجع للكشف عن التضخمات أو الحذف، وهي فكرة رائدة في التهجين الجينومي المقارن (Kallioniemi et al., 1992).

Clinical relevance

تُستخدم الطرق الكمية وطرق عدد النسخ لقياس الحمل الممرض، والتعبير الجيني، والاكتساب أو الفقدان الجينومي. يشرح هذا المدخل كيفية عمل التقدير الكمي كمرجع منهجي؛ ولا يقدم نصائح بشأن اختيار أو تفسير أو اتخاذ إجراءات بناءً على أي فحص كمي محدد في رعاية المرضى.

Evidence & guidelines

تُوجه عملية الإبلاغ عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بواسطة توصيات MIQE، التي تحدد الحد الأدنى من المعلومات اللازمة للنشر القابل للتكرار (Bustin et al., 2009). تصف الدراسات الأولية التأسيسية التقدير الكمي في الوقت الفعلي (Heid et al., 1996)، والتقدير الكمي الرقمي المطلق (Hindson et al., 2011)، وقياس عدد النسخ على مستوى الجينوم (Kallioniemi et al., 1992).

History

في منتصف التسعينيات، حوّل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي التضخيم من أداة نوعية إلى أداة كمية (Heid et al., 1996)، وتبع ذلك معايير الإبلاغ المتفق عليها بعد عقد من الزمان (Bustin et al., 2009). ثم أتاح تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي، وخاصة تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القطيري، العد المطلق للجزيئات بدقة عالية (Hindson et al., 2011)، بينما تطور تقييم عدد النسخ من التهجين الجينومي المقارن نحو الطرق القائمة على المصفوفات والتسلسل (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

كيف يختلف تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي؟

يقدر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي الكمية الأولية للمادة المستهدفة من مدى سرعة تجاوز الإشارة الفلورية لعتبة معينة، عادةً بالنسبة إلى معيار، بينما يقسم تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي العينة ويعد الأقسام الإيجابية لإعطاء عدد جزيئات مطلق دون الحاجة إلى منحنى قياسي.

ماذا يقيس تقييم عدد النسخ؟

يحدد عدد نسخ منطقة جينومية معينة الموجودة بالنسبة إلى مرجع، ويكشف عن التضخمات (الاكتساب) أو الحذف (الفقدان) لتلك المنطقة.