Kantitatif Gen İfadesi Analizi
Kantitatif gen ifadesi analizi, bir doku veya hücre popülasyonunda bir genin ne kadar ifade edildiğini, haberci RNA transkriptlerini veya protein ürünlerini kantifiye ederek ölçmek için kullanılan moleküler yöntemler bütünüdür. Moleküler patoloji kapsamında, bir örneğin moleküler aktivitesini tanı, sınıflandırma ve prognoz ile ilişkilendiren sayısal kanıtlar sunmaktadır.
Tanım
Kantitatif gen ifadesi analizi, hücrelerin veya dokuların moleküler durumunu karakterize etmek amacıyla, biyolojik bir örnekteki gen ürünlerinin (RNA transkriptleri veya proteinler) bolluğunun göreceli veya mutlak bir ölçekte ifade edilerek ölçülmesidir.
Kapsam
Bu alan, okuyucuyu patoloji ve laboratuvar tıbbında kullanılan başlıca kantitatif platformlar hakkında bilgilendirmektedir: gerçek zamanlı ve kantitatif PCR, RNA dizileme ve transkriptomik, immünohistokimya ve diğer protein saptama yöntemleri, bu ölçümlerden elde edilen prognostik gen ifadesi imzaları ve sayıları güvenilir kılan kalite güvence uygulamaları. Bu platformlar, klinik talimatlar yerine ölçüm metodolojileri olarak ele alınmaktadır.
Alt konular
Temel sorular
- Bir transkript veya proteinin bolluğu nasıl ölçülür ve normalize edilir?
- Göreceli bir ölçüm ne zaman yeterlidir ve mutlak kantifikasyon ne zaman gereklidir?
- İfade ölçümleri tanısal veya prognostik sınıflandırmaya nasıl dönüştürülür?
- Hangi kontroller ve standartlar, kantitatif bir sonucu laboratuvarlar arasında tekrarlanabilir kılar?
Anahtar kavramlar
- Transkript bolluğu ve protein bolluğu
- Göreceli ve mutlak kantifikasyon
- Normalizasyon ve referans genler
- Gen ifadesi imzaları
- Analitik geçerlilik ve tekrarlanabilirlik
- Pre-analitik, analitik ve post-analitik fazlar
Mekanizmalar
Tüm kantitatif ifade yöntemleri, moleküler bir niceliği, hedefin miktarıyla ölçeklenen ölçülebilir bir sinyale dönüştürmektedir. Ters transkripsiyon kantitatif PCR, cDNA'yı amplifiye etmekte ve floresansın bir eşiği geçtiği döngüyü okumaktadır; göreceli kantifikasyon genellikle karşılaştırmalı 2-DDCT yaklaşımı (Livak & Schmittgen, 2001) ile rapor edilmektedir. RNA dizileme, transkriptlere eşlenen okumaları sayarak, dizileme derinliğini ifade tahminlerine dönüştürmektedir (Wang ve ark., 2009). İmmünohistokimya, işaretli antikorlarla proteini saptamakta ve boyanma yoğunluğunu ve yaygınlığını rapor etmektedir. Platformlar genelinde, biyolojik farklılıkların teknik varyasyondan ayrılabilmesi için ham sinyalin referans standartlara normalize edilmesi gerekmektedir; bu gereklilik, qPCR için MIQE kılavuzları (Bustin ve ark., 2009) tarafından resmileştirilmiştir.
Klinik önem
Kantitatif ifade ölçümleri, moleküler tümör sınıflandırmasının, biyobelirteç raporlamasının ve çok genli prognostik testlerin temelini oluşturmakta olup, bunların eleştirel bir şekilde okunması laboratuvar tıbbı pratiğinin bir parçasıdır. Bu madde, bu tür ölçümlerin bir yöntem alanı olarak nasıl üretildiğini ve yorumlandığını açıklamaktadır; valide edilmiş testlere ve klinik kılavuzlara ait olan tanısal eşiklerin veya tedavi kararlarının bir kaynağı değildir.
Kanıt ve kılavuzlar
Metodolojik literatür, qPCR için MIQE kılavuzları (Bustin ve ark., 2009) gibi raporlama standartlarını, RNA-seq'in kantitatif bir platform olarak temel tanımlarını (Wang ve ark., 2009; Mortazavi ve ark., 2008) ve ifade profillerinin prognostik bilgi taşıdığına dair dönüm noktası niteliğindeki gösterimleri (van 't Veer ve ark., 2002) kapsamaktadır. Bunlar birlikte, hem teknikleri hem de sonuçlarının değerlendirildiği standartları tanımlamaktadır.
Tarihçe
Kantitatif ifade analizi, düşük verimli Northern blotlar ve erken RT-PCR'dan 1990'larda gerçek zamanlı PCR'a, 2000'li yıllarda mikroarray tabanlı profillemeye ve 2000'li yılların sonlarından itibaren yüksek verimli RNA dizilemeye doğru gelişmiştir. 2002 meme kanseri profilleme çalışması (van 't Veer ve ark.), ifade paternlerinin sonucu tahmin edebileceğini göstermiş ve 2009 MIQE kılavuzları, standartlaştırılmış, tekrarlanabilir kantifikasyona doğru bir değişimi işaret etmiştir.
Öne çıkan isimler
- Stephen Bustin
- Kenneth Livak
- Laura van 't Veer
İlgili konular
Temel eserler
- bustin-2009
- wang-2009
- vantveer-2002
- livak-2001
Sıkça sorulan sorular
- Göreceli ve mutlak kantifikasyon arasındaki fark nedir?
- Göreceli kantifikasyon, bir hedefin ifadesini bir referansla karşılaştırır (örneğin, qPCR'daki karşılaştırmalı 2-DDCT yöntemi), mutlak kantifikasyon ise kalibre edilmiş bir standarda göre gerçek kopya sayısını veya konsantrasyonu rapor eder. Çoğu ifade çalışması göreceli ölçümleri kullanır; mutlak ölçümler ek kalibrasyon gerektirir.
- İfade analizinde normalizasyon neden gereklidir?
- Ham sinyal hem biyolojik ifadeyi hem de girdi miktarı, verimlilik ve dizileme derinliği gibi teknik faktörleri yansıtır; referans genlere veya standartlara normalizasyon, teknik bileşeni ortadan kaldırarak ölçülen farklılıkların gerçek biyolojiyi yansıtmasını sağlar.