Gerçek Zamanlı Kantitatif Analiz ve Kopya Sayısı Değerlendirmesi
Kantitatif moleküler yöntemler, bir hedef nükleik asidin sadece tespit edilebilir olup olmadığını değil, ne kadar bulunduğunu ölçmektedir. Gerçek zamanlı kantitatif PCR, amplifikasyonu gerçekleştiği anda takip etmekte, dijital PCR, molekülleri mutlak olarak saymak için bir örneği bölümlere ayırmakta ve kopya sayısı değerlendirmesi, bir genomik bölgenin kazanılıp kazanılmadığını veya kaybedilip kaybedilmediğini belirlemektedir.
Tanım
Gerçek zamanlı kantitatif analiz, genellikle amplifikasyon sırasında floresan sinyali izleyerek (gerçek zamanlı PCR) veya pozitif bölmeleri sayarak (dijital PCR) bir hedef nükleik asidin miktarını ölçmektedir; kopya sayısı değerlendirmesi ise bir genomik bölgenin referansa göre kopya sayısını belirlemektedir.
Kapsam
Bu konu, gerçek zamanlı (kantitatif) PCR, dijital ve damlacık dijital PCR ile kopya sayısı değerlendirme yaklaşımlarını kapsamaktadır. Kantifikasyon prensiplerini ve sonuçları karşılaştırılabilir kılan hususları ele almakta olup, klinik test rehberliği yerine metodolojik referans materyali olarak sunulmaktadır.
Anahtar kavramlar
- Gerçek zamanlı (kantitatif) PCR
- Kantifikasyon döngüsü (Cq) ve amplifikasyon verimliliği
- Standart eğriler ve göreceli kantifikasyon
- Dijital ve damlacık dijital PCR
- Bölümleme ile mutlak kantifikasyon
- Kopya sayısı kazanımları ve kayıpları
- Raporlama standartları ve tekrarlanabilirlik
Mekanizmalar
Gerçek zamanlı PCR, amplifikasyonu, ürün birikimiyle orantılı olarak sinyali artan bir floresan raportöre bağlamaktadır; sinyalin bir eşiği geçtiği döngü, başlangıçtaki hedef miktarını yansıtmakta ve göreceli veya standart eğri kantifikasyonuna olanak tanımaktadır (Heid ve ark., 1996). Dijital PCR ise örneği, her birinin sıfır veya birkaç molekül içerdiği birçok küçük bölmeye dağıtmaktadır; pozitif bölmelerin oranını saymak ve Poisson istatistiklerini uygulamak, standart bir eğri olmaksızın mutlak bir sayım sağlamaktadır (Hindson ve ark., 2011). Kopya sayısı değerlendirmesi, amplifikasyonları veya delesyonları tespit etmek için bir hedef bölgenin bolluğunu bir referansla karşılaştırmaktadır; bu fikir, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (comparative genomic hybridization) ile öncülük edilmiştir (Kallioniemi ve ark., 1992).
Klinik önem
Kantitatif ve kopya sayısı yöntemleri, patojen yükünü, gen ekspresyonunu ve genomik kazanım veya kayıpları ölçmek için kullanılmaktadır. Bu madde, kantifikasyonun metodolojik bir referans olarak nasıl çalıştığını açıklamakta olup, hasta bakımında herhangi bir spesifik kantitatif tahlilin seçilmesi, yorumlanması veya buna göre hareket edilmesi konusunda tavsiye vermemektedir.
Kanıt ve kılavuzlar
Kantitatif PCR raporlaması, tekrarlanabilir yayın için gereken minimum bilgiyi belirten MIQE önerileri tarafından yönlendirilmektedir (Bustin ve ark., 2009). Temel birincil çalışmalar, gerçek zamanlı kantifikasyonu (Heid ve ark., 1996), mutlak dijital kantifikasyonu (Hindson ve ark., 2011) ve genom çapında kopya sayısı ölçümünü (Kallioniemi ve ark., 1992) tanımlamaktadır.
Tarihçe
1990'ların ortalarında gerçek zamanlı PCR, amplifikasyonu kalitatif bir araçtan kantitatif bir araca dönüştürmüştür (Heid ve ark., 1996) ve mutabakat raporlama standartları on yıl sonra belirlenmiştir (Bustin ve ark., 2009). Dijital PCR ve özellikle damlacık dijital PCR, daha sonra moleküllerin yüksek hassasiyetle mutlak sayımını sağlamıştır (Hindson ve ark., 2011), kopya sayısı değerlendirmesi ise karşılaştırmalı genomik hibridizasyondan dizi (array) ve sekanslama tabanlı yöntemlere doğru evrilmiştir (Kallioniemi ve ark., 1992).
Öne çıkan isimler
- Christian Heid
- Stephen Bustin
- Benjamin Hindson
İlgili konular
Temel eserler
- heid-1996
- hindson-2011
- bustin-2009
Sıkça sorulan sorular
- Dijital PCR, gerçek zamanlı kantitatif PCR'dan nasıl farklılık göstermektedir?
- Gerçek zamanlı PCR, floresan sinyalinin bir eşiği ne kadar erken geçtiğinden, genellikle bir standarda göre, hedef başlangıç miktarını tahmin ederken; dijital PCR, örneği bölümlere ayırır ve pozitif bölmeleri sayarak standart bir eğri olmaksızın mutlak bir molekül sayısı vermektedir.
- Kopya sayısı değerlendirmesi neyi ölçmektedir?
- Bir referansa göre belirli bir genomik bölgenin kaç kopyasının bulunduğunu belirleyerek, o bölgenin amplifikasyonlarını (kazanımlarını) veya delesyonlarını (kayıplarını) tanımlamaktadır.
Bu kavram için yöntemler
- Copy Number Variation Analysis
- Differential Copy Number Variation Analysis
- Time-series copy number variation analysis
- Bayesian Copy Number Variation Analysis
- Single-cell Copy Number Variation Analysis
- Machine learning-assisted copy number variation analysis
- Single-cell variant calling
- RNA-seq Differential Expression