Gerçek Zamanlı PCR ve Kantitatif PCR Uygulamaları
Kantitatif PCR (qPCR) olarak da adlandırılan gerçek zamanlı PCR, yükseltilmiş DNA'nın bir floresan sinyali aracılığıyla döngüden döngüye birikimini ölçerek, hedef dizinin başlangıç miktarının tahmin edilmesini sağlamaktadır. Ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile birleştirildiğinde, moleküler patolojide gen ekspresyonunu kantifiye etmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir.
Tanım
Gerçek zamanlı kantitatif PCR, bir nükleik asit amplifikasyon yöntemidir. Bu yöntem, ürün oluşumunu floresans aracılığıyla gerçek zamanlı olarak izler ve bir DNA veya (ters transkripsiyondan sonra) RNA hedefinin başlangıç miktarını tahmin etmek için kantifikasyon döngüsünü kullanır.
Kapsam
Bu konu, gerçek zamanlı PCR'ın ölçüm prensibini, kantifikasyon döngüsünü (Cq) ve şablon miktarıyla ilişkisini, karşılaştırmalı 2-DDCT yöntemiyle göreceli kantifikasyonu, referans genlerin ve amplifikasyon verimliliğinin rolünü ve tekrarlanabilirliği yöneten raporlama standartlarını kapsamaktadır. Ayrıca, ilgili bir mutlak kantifikasyon yaklaşımı olarak dijital PCR'ı da belirtmektedir. Bunlar, klinik test protokolleri olarak değil, laboratuvar yöntemleri olarak ele alınmaktadır.
Temel sorular
- Kantifikasyon döngüsü, başlangıç şablonu miktarıyla nasıl ilişkilidir?
- RT-qPCR'da göreceli ekspresyon nasıl hesaplanır ve normalize edilir?
- Amplifikasyon verimliliği ve referans gen seçimi sonucu neden etkiler?
- Dijital PCR, kantifikasyonu sağlamada gerçek zamanlı PCR'dan nasıl farklıdır?
Anahtar kavramlar
- Kantifikasyon döngüsü (Cq / Ct)
- Amplifikasyon verimliliği
- Karşılaştırmalı 2-DDCT yöntemi
- Referans (housekeeping) genler
- Ters transkripsiyon qPCR
- Dijital PCR ve bölme
- MIQE raporlama standartları
Mekanizmalar
PCR sırasında, hedef dizi üstel fazda her döngüde iki katına çıkmaktadır ve floresan bir raportör (bir interkalasyon boyası veya diziye özgü bir prob), biriken ürünle orantılı bir sinyal yaymaktadır. Floresansın tanımlanmış bir eşiği geçtiği döngü (kantifikasyon döngüsü, Cq veya Ct), başlangıç şablon miktarının logaritmasıyla ters orantılıdır; bu nedenle daha düşük bir Cq, daha fazla hedef anlamına gelmektedir. Göreceli ekspresyon en yaygın olarak, hedefin Cq değerini bir referans gene ve bir kalibratör örneğine normalize eden, yaklaşık eşit amplifikasyon verimlilikleri varsayan karşılaştırmalı 2-DDCT yöntemiyle hesaplanmaktadır (Livak & Schmittgen, 2001). Verimlilik, referans gen stabilitesi ve ters transkripsiyon değişkenliği tahminleri etkilediği için, MIQE kılavuzları, bir sonucun yorumlanabilir olması için gerekli deneysel detayları ve doğrulamayı belirtmektedir (Bustin et al., 2009). Dijital PCR ise örneği birçok reaksiyona bölerek pozitif bölmeleri sayar ve standart bir eğri olmaksızın mutlak kantifikasyon sağlamaktadır (Huggett et al., 2013).
Klinik önem
RT-qPCR, moleküler tanısal ve prognostik okumaların arkasındaki transkript seviyelerini ölçmek için rutin bir platformdur ve varsayımlarını anlamak, laboratuvar raporlarını yorumlamanın bir parçasıdır. Bu girdi, yöntemi ve sınırlamalarını açıklamaktadır ve doğrulanmış testlere bağlı olan tanısal kesme noktaları veya hasta yönetimi için bir temel oluşturmamaktadır.
Kanıt ve kılavuzlar
Gerçek zamanlı PCR için raporlama ve kalite beklentileri MIQE kılavuzlarında (Bustin et al., 2009) ve dijital PCR için dijital MIQE kılavuzlarında (Huggett et al., 2013) belirtilmiştir. Karşılaştırmalı 2-DDCT yöntemi (Livak & Schmittgen, 2001), göreceli kantifikasyon için standart referans olmaya devam etmektedir.
Tarihçe
Gerçek zamanlı PCR, floresan tespitinin termal döngüleme ile birleştirildiği 1990'larda ortaya çıkmış ve yoğun emek gerektiren uç nokta kantifikasyonunun yerini almıştır. Karşılaştırmalı 2-DDCT yöntemi (2001) göreceli kantifikasyonu standartlaştırmış, MIQE kılavuzları (2009) yaygın tekrarlanabilirlik sorunlarını ele almış ve dijital PCR daha sonra alanı mutlak kantifikasyona doğru genişletmiştir.
Tartışmalar
- Normalizasyon için referans genler nasıl seçilmelidir?
- Göreceli kantifikasyon, koşullar arasında kararlı referans gen ekspresyonu varsaymaktadır, ancak tek housekeeping genler değişkenlik gösterebilir; yanlı normalizasyonu önlemek için doğrulanmış çoklu referans genlerin kullanılması önerilmektedir.
Öne çıkan isimler
- Stephen Bustin
- Kenneth Livak
- Thomas Schmittgen
- Jim Huggett
İlgili konular
Temel eserler
- livak-2001
- bustin-2009
- huggett-2013
Sıkça sorulan sorular
- Daha düşük bir Ct değeri ne anlama gelir?
- Daha düşük bir kantifikasyon döngüsü (Ct veya Cq), floresansın eşiği daha erken geçtiği anlamına gelir, bu da daha fazla başlangıç hedef şablonu olduğunu gösterir; Ct, başlangıç miktarının logaritmasıyla ters orantılıdır.
- Dijital PCR, gerçek zamanlı qPCR'dan nasıl farklıdır?
- Dijital PCR, reaksiyonu birçok küçük bölmeye ayırır ve kaç tanesinin hedef içerdiğini sayarak standart bir eğri olmaksızın mutlak bir sayı verirken, gerçek zamanlı qPCR, miktarı kantifikasyon döngüsünden çıkarır, genellikle göreceli bir ölçü olarak.