Mikrodizi Tabanlı Ekspresyon Profillendirme
Bir DNA mikrodizisi, bir örnekten alınan işaretli nükleik asitleri katı bir yüzeye sabitlenmiş tamamlayıcı probların yoğun, düzenli bir ızgarasına hibridize ederek gen ekspresyonunu ölçmektedir; her bir probdaki floresans, ilgili transkriptin ne kadar bulunduğunu yansıtmaktadır. Mikrodiziler, 1990'ların sonları ve 2000'lerde genom ölçekli ekspresyon profillendirmeyi rutin hale getirmiş ve ölçülecek transkript setinin önceden bilindiği durumlarda tanımlanmış, uygun maliyetli bir platform olarak kalmaya devam etmektedir.
Tanım
Mikrodizi tabanlı ekspresyon profillendirme, işaretli örnek nükleik asitlerin tamamlayıcı DNA veya oligonükleotit probların sabit bir dizisine hibridizasyon sinyalini ölçerek transkript bolluğunu nicelendirmekte ve prob uygulanan her gen için göreceli bir ekspresyon değeri sağlamaktadır.
Kapsam
Bu konu, ekspresyon mikrodizilerinin tasarımını ve kullanımını kapsamaktadır: prob düzeni, örnek işaretleme ve hibridizasyon, görüntü tabanlı sinyal alımı ve ham prob yoğunluklarını karşılaştırılabilir ekspresyon değerlerine dönüştürmek için gereken normalizasyon ve özetleme. Bu, transkriptomik içinde metodolojik bir referanstır ve klinik rehberlik sunmamaktadır.
Temel sorular
- Problar, ilgi duyulan genleri temsil etmek üzere nasıl tasarlanır ve dizilir?
- Hibridizasyon sinyali transkript bolluğu ile nasıl ilişkilidir?
- Ham prob yoğunlukları, gen başına ekspresyon değerlerine nasıl normalize edilir ve özetlenir?
- Sabit prob dizisi, transkriptlerin doğrudan dizilenmesine ne zaman tercih edilir?
Anahtar kavramlar
- Prob ve dizi tasarımı
- Hibridizasyon ve floresan işaretleme
- İki renkli ve tek kanallı diziler
- Arka plan düzeltmesi ve normalizasyon
- Prob düzeyinde özetleme (örn. RMA)
- Çapraz hibridizasyon ve doygunluk
- Sabit prob seti (kapalı ölçüm)
Mekanizmalar
Bir örnekten hazırlanan işaretli tamamlayıcı DNA veya RNA, bilinen dizilere sahip binlerce probun adreslenebilir konumlarda sabitlendiği bir diziye uygulanmaktadır. Tamamlayıcı moleküller kendi problarına hibridize olmakta ve bir tarayıcı her noktadaki floresans yoğunluğunu kaydetmektedir; bu, eşleşen transkriptin bolluğunun göreceli bir ölçüsü olarak kabul edilmektedir. Yoğunluk arka plan, prob afinitesi ve diziden diziye varyasyondan etkilendiği için, ham sinyallerin arka plan düzeltmesi yapılmalı, diziler arasında normalize edilmeli ve gen başına birden fazla probdan tek bir ekspresyon tahminine özetlenmesi gerekmektedir; Irizarry ve arkadaşlarının Robust Multi-array Average (RMA) yöntemi yaygın olarak kullanılan bir özetleme çerçevesidir. Schena ve arkadaşları cDNA mikrodizisini tanıtmış, Lockhart ve arkadaşları ise yüksek yoğunluklu oligonükleotit dizilerini kantitatif bir ekspresyon izleme platformu olarak kurmuşlardır.
Klinik önem
Mikrodiziler, hastalıkların etkili moleküler sınıflandırmalarını üretmiş ve araştırma ve translasyonel ortamlarda kullanılan çeşitli erken gen ekspresyon imzalarının arkasındaki platform olmuştur. Bir referans konu olarak bu giriş, dizi tabanlı ekspresyon kanıtının nasıl üretildiğini ve normalize edildiğini açıklamaktadır; bireysel tanı veya tedavi kararları için bir temel oluşturmamaktadır.
Kanıt ve kılavuzlar
Metodolojik temeller, Schena ve arkadaşlarının (cDNA dizileri) ve Lockhart ve arkadaşlarının (oligonükleotit dizileri) platform makaleleri ile RMA (Irizarry ve arkadaşları) gibi normalizasyon ve özetleme yöntemleridir. Bunlar klinik kılavuzlardan ziyade metodolojik referanslardır.
Tarihçe
Ekspresyon mikrodizileri 1990'ların ortalarında tanıtılmış, Schena ve arkadaşları 1995'te bir cDNA mikrodizisini göstermiş ve Lockhart ve arkadaşları 1996'da yüksek yoğunluklu oligonükleotit dizilerini tanımlamışlardır. Sonraki on yıl boyunca diziler, genom ölçekli ekspresyon çalışmaları için baskın araç haline gelmiş ve normalizasyon ile prob özetleme için istatistiksel yöntemler olgunlaşmıştır. 2000'lerin sonlarından itibaren, RNA dizileme keşif çalışmaları için dizilerin yerini giderek almıştır, ancak tanımlanmış bir prob setinin ve daha düşük maliyetin avantajlı olduğu yerlerde diziler varlığını sürdürmüştür.
Tartışmalar
- Mikrodiziler ve RNA dizileme karşılaştırması
- Diziler yalnızca sabit probları tarafından temsil edilen transkriptleri ölçmekte ve daha dar bir dinamik aralığa sahipken, dizileme transkriptleri doğrudan ölçmekte ve yeni transkriptleri keşfedebilmektedir; tanımlanmış, daha ucuz bir kapalı analiz ile açık bir keşif platformu arasındaki denge, platform seçimini bilgilendirmeye devam etmektedir.
Öne çıkan isimler
- Patrick O. Brown
- Mark Schena
- David J. Lockhart
- Rafael Irizarry
İlgili konular
Temel eserler
- schena-1995
- lockhart-1996
- irizarry-2003
Sıkça sorulan sorular
- Bir mikrodizi neden yalnızca tasarlandığı transkriptleri ölçebilir?
- Sinyal, diziye sabitlenmiş bilinen diziye sahip problara hibridizasyondan kaynaklanmaktadır, bu nedenle eşleşen probu olmayan herhangi bir transkript tespit edilememektedir. Bu durum, mikrodizileri, transkriptleri doğrudan örnekleyen dizilemenin aksine, kapalı bir analiz haline getirmektedir.
- Mikrodizi verilerinde normalizasyon neyi düzeltir?
- Normalizasyon, farklı arka plan, işaretleme verimliliği ve diziden diziye yoğunluk farklılıkları gibi teknik varyasyonları ayarlamaktadır, böylece ortaya çıkan ekspresyon değerleri deneysel artefaktlardan ziyade biyolojik farklılıkları yansıtmaktadır.