RNA Dizileme ve Transkriptomik
RNA dizileme (RNA-seq), yüksek verimli dizileme yoluyla bir örnekteki RNA moleküllerinin kimliğini ve bolluğunu belirleyerek gen ekspresyonunun nicel, genom çapında bir resmini sunmaktadır. Transkriptomik, bu eksiksiz transkript setinin, yani transkriptomun ve dokular, koşullar ve hastalık durumları arasında nasıl değiştiğinin incelenmesidir.
Tanım
RNA dizileme, RNA'yı dizilenmiş fragmanlardan oluşan bir kütüphaneye dönüştüren ve bir hücre veya dokuda bulunan eksiksiz RNA molekülleri seti olan transkriptom boyunca ekspresyonu nicel olarak belirlemek için genlere veya transkriptlere eşlenen okumaları sayan bir yöntemdir.
Kapsam
Bu konu, RNA-seq'in dizi okumalarını ekspresyon tahminlerine nasıl dönüştürdüğünü, transkriptomun dinamik bir çıktı olarak anlamını, yaygın niceleme birimlerini ve dizileme tabanlı ölçüme özgü kalite ve standardizasyon sorunlarını kapsamaktadır. RNA-seq'i klinik bir test protokolü olarak değil, bir ölçüm ve keşif platformu olarak ele almaktadır.
Temel sorular
- Dizileme okumaları nicel ekspresyon tahminlerine nasıl dönüştürülür?
- Transkriptom, sabit bir gen listesinin ötesinde neleri yakalar?
- Normalizasyon ve okuma derinliği karşılaştırılabilirliği nasıl etkiler?
- RNA-seq'in doğruluğu ve tekrarlanabilirliği nasıl değerlendirilir?
Anahtar kavramlar
- Transkriptom
- Okuma eşleme ve sayım
- Normalizasyon (örn. derinlik ve uzunluk ölçeklendirmesi)
- Diferansiyel ekspresyon
- Spike-in kontrolleri
- Tek hücreli ve toplu transkriptomik
Mekanizmalar
RNA izole edilir, cDNA'ya ters transkripsiyonu yapılır, fragmanlara ayrılır ve bir dizileme kütüphanesi haline getirilir; elde edilen okumalar bir referans genom veya transkriptoma hizalanır ve her bir özelliğin üzerine binen okuma sayısı, ekspresyonuyla orantılı bir sayım sağlamaktadır (Mortazavi et al., 2008). Toplam okuma derinliği ve transkript uzunluğu ham sayımları etkilediğinden, transkriptler karşılaştırılmadan önce veriler normalleştirilir ve bolluk genellikle uzunluk ve derinlik ölçekli birimlerle ifade edilmektedir. RNA-seq, yeni transkriptleri, ek varyantlarını ve geniş bir dinamik ekspresyon aralığını tespit edebilir, bu da onu önceki hibridizasyon tabanlı profillemeden ayırmaktadır (Wang et al., 2009). Platformun doğruluğunu ve sınırlarını karakterize etmek için harici spike-in standartları ve konsorsiyum kıyaslamaları kullanılmaktadır (Jiang et al., 2011; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).
Klinik önem
RNA-seq, moleküler tümör profillemesi, füzyon tespiti ve ekspresyon tabanlı sınıflandırmanın giderek artan bir şekilde temelini oluşturmaktadır ve bu tür verileri yorumlamak, sayımların ekspresyon tahminlerine nasıl dönüştüğünü anlamayı gerektirmektedir. Bu giriş, yöntemi ve nicel özelliklerini açıklamaktadır; doğrulanmış testlere ve klinik kriterlere dayanan tanısal yorumlar veya tedavi rehberliği sağlamamaktadır.
Kanıt ve kılavuzlar
RNA-seq'in nicel bir yöntem olarak temel tanımlamaları (Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009), harici spike-in standartları (Jiang et al., 2011) ve RNA-seq performansının SEQC/MAQC-III kıyaslaması (2014) dahil olmak üzere doğruluk ve tekrarlanabilirlik üzerine topluluk çabalarıyla desteklenmektedir.
Tarihçe
Transkriptom ölçümü, 2000'li yılların sonlarında, yeni nesil dizilemenin tüm transkriptom okuma sayımını pratik hale getirmesiyle, eksprese edilmiş dizi etiketi ve mikroarray yaklaşımlarından doğrudan dizilemeye geçmiştir (Mortazavi et al., 2008). RNA-seq hızla ekspresyon çalışmaları için bir standart haline gelmiş ve sonraki konsorsiyum çalışmaları, ölçümlerinin nasıl karşılaştırılabilir ve tekrarlanabilir hale getirileceğini ele almıştır (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).
Tartışmalar
- RNA-seq sayımları karşılaştırma için nasıl normalleştirilmelidir?
- Ham sayımlar dizileme derinliğine ve transkript uzunluğuna bağlıdır ve farklı normalizasyon seçimleri hangi genlerin diferansiyel olarak eksprese edildiğini değiştirebilir; uygun normalizasyon ve kontrollerin seçimi metodolojik bir endişe olmaya devam etmektedir.
Öne çıkan isimler
- Zhong Wang
- Michael Snyder
- Ali Mortazavi
- Barbara Wold
İlgili konular
Temel eserler
- wang-2009
- mortazavi-2008
- seqc-2014
Sıkça sorulan sorular
- Transkriptom nedir?
- Transkriptom, belirli bir zamanda bir hücrede veya dokuda bulunan eksiksiz RNA transkriptleri setidir; koşullara ve hücre tipine göre değiştiği için, onu ölçmek hangi genlerin aktif olduğunu ve hangi seviyede olduğunu göstermektedir.
- RNA-seq, ekspresyon için mikroarraylerden nasıl farklıdır?
- RNA-seq, RNA'yı doğrudan diziler ve sayar, bu nedenle yeni transkriptleri ve ek varyantlarını tespit edebilir ve geniş bir dinamik aralığı kapsar; oysa mikroarrayler önceden tanımlanmış problara hibridizasyonu ölçer ve bilinen dizilerle sınırlıdır.
Bu kavram için yöntemler
- RNA-seq Differential Expression
- Single-cell RNA-seq analysis
- Bayesian RNA-seq differential expression
- Time-series single-cell RNA-seq analysis
- De Novo Transcriptome Assembly
- Differential single-cell RNA-seq analysis
- Multi-omics RNA-seq differential expression
- Machine learning-assisted RNA-seq differential expression