Moleküler Tanı: PCR ve Dizileme
Moleküler yöntemler, mantarları büyüme veya görünüşlerine göre değil, nükleik asitleri aracılığıyla tespit ve teşhis etmektedir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), örneklerden veya izolatlarından mantar DNA'sını çoğaltmakta; ribozomal gen kümesinin iç transkribe edici aralığı (internal transcribed spacer) gibi korunmuş bölgelerin dizilenmesi ise çoğaltılmış DNA'yı okuyarak organizmayı adlandırmaktadır. Bu yöntem genellikle kültürden daha hızlı ve daha hassas sonuçlar vermektedir.
Tanım
Mantarlar için moleküler tanı, mantar nükleik asitlerini çoğaltan ve analiz eden tekniklerdir; mantar DNA'sını tespit etmek için PCR ve organizmayı cins veya tür düzeyinde tanımlamak için iç transkribe edici aralık gibi korunmuş bölgelerin DNA dizilemesi kullanılmaktadır.
Kapsam
Bu konu, türe özgü ve geniş spektrumlu (panfungal) PCR, gerçek zamanlı PCR, ITS gibi barkodlama bölgelerinin DNA dizilemesi ve bu yöntemlerin kültür izolatları ile formalinle sabitlenmiş doku dahil olmak üzere doğrudan klinik materyal üzerinde kullanımını kapsamaktadır. Bu yöntemler, tanımlama ve tespit metotları olarak ele alınmakta olup, herhangi bir test veya tedavi talimatı sunmamaktadır.
Temel sorular
- Bu örnekte mantar DNA'sı mevcut mu ve hangi organizmadan gelmektedir?
- Geniş spektrumlu panfungal PCR, türe özgü bir testten ne zaman daha tercih edilebilir?
- İlgili mantarları en iyi hangi genomik bölge ayırt etmektedir?
- Kontaminasyon ve canlı olmayan DNA'yı tespit etme riskleri göz önüne alındığında moleküler sonuçlar nasıl yorumlanmaktadır?
Anahtar kavramlar
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
- Türe özgü ve geniş spektrumlu (panfungal) PCR
- Gerçek zamanlı (kantitatif) PCR
- Mantar barkodu olarak iç transkribe edici aralık (ITS)
- DNA dizilemesi ve referans veri tabanları
- İzolatlarda tespit ve doğrudan dokuda tespit
- Kontaminasyon kontrolü ve hücre dışı DNA'nın yorumlanması
Mekanizmalar
PCR, hedef DNA'yı tekrarlayan döngüler aracılığıyla çoğaltmak için primerler ve termostabil bir polimeraz kullanmakta, böylece az miktardaki mantar genetik materyalini bile tespit edebilecek kadar kopya üretmektedir. Türe özgü testler bilinen bir organizmayı hedeflerken, geniş spektrumlu veya panfungal testler birçok mantar tarafından paylaşılan korunmuş bölgelere karşı primerler kullanmakta, ardından dizileme kimliği ortaya koymaktadır. Ribozomal RNA gen kümesinin iç transkribe edici aralık bölgesi, White ve arkadaşları tarafından tanımlanan korunmuş primerlerle çevrili olup, türler arasında evrensel bir mantar barkodu olarak işlev görecek kadar değişkendir ve okunan dizi, organizmayı adlandırmak için referans veri tabanlarıyla eşleştirilmektedir. Gerçek zamanlı PCR, kantifikasyon ve hız sağlamakta olup, testler kültürlenmiş izolatlar üzerinde veya formalinle sabitlenmiş doku dahil olmak üzere doğrudan klinik örnekler üzerinde yapılabilmektedir; ancak bozunmuş DNA ve çevresel kontaminasyon yorumlamayı zorlaştırmaktadır. PCR, canlı hücreler yerine DNA'yı tespit ettiği için, sonuçlar kültür, mikroskopi ve antijen bulgularıyla birlikte değerlendirilmektedir.
Klinik önem
Moleküler tespit ve dizileme, mantarların nasıl tanımlandığını ve bazı enfeksiyonların nasıl tanındığını giderek daha fazla desteklemekte olup, belirli PCR sonuçları olası invaziv mantar hastalığının konsensüs kategorilerine katkıda bulunmaktadır. Bu madde, yöntemleri ve yorumlama sınırlamalarını referans materyal olarak tanımlamakta ve test veya hasta bakımına yönelik bir yönlendirme içermemektedir.
Kanıt ve kılavuzlar
EORTC/MSGERC'den gelen konsensüs tanımları, olası invaziv mantar hastalığı için mikolojik kriterler arasına belirtilen PCR sonuçlarını dahil etmekte, bu da moleküler yöntemlerin olgunlaşmasını yansıtmaktadır; en iyi uygulama önerileri ise bunların kültür ve antijen testlerinin yanı sıra yerini tanımlamaktadır. ITS dizileme yaklaşımı, White ve arkadaşları tarafından yayımlanan yaygın olarak kullanılan primerlere dayanmaktadır.
Tarihçe
Polimeraz zincir reaksiyonunun 1980'lerde geliştirilmesinden sonra, White ve arkadaşlarının 1990'da mantar ribozomal RNA genlerini çoğaltmak ve doğrudan dizilemek için primerler yayımlamasıyla mantarlara uygulanması hızla ilerlemiş, ITS bölgesini filogenetik ve daha sonra tanısal bir belirteç olarak kabul ettirmiştir. Gerçek zamanlı PCR, geniş spektrumlu panfungal testler ve yüksek verimli dizileme, moleküler mikolojiyi araştırmadan rutin tanımlama ve tespit alanına taşımıştır.
İlgili konular
Temel eserler
- white-1990
- donnelly-2020
Sıkça sorulan sorular
- ITS bölgesi nedir ve mantarları tanımlamak için neden kullanılmaktadır?
- İç transkribe edici aralık (ITS), mantar ribozomal gen kümesinin bir parçası olup, korunmuş dizilerle çevrili olmasına rağmen türler arasında yeterince farklılık göstermesi nedeniyle dizileme tabanlı mantar tanımlaması için pratik bir evrensel barkod görevi görmektedir.
- Pozitif bir mantar PCR'ı aktif enfeksiyonu kanıtlar mı?
- Tek başına kanıtlamaz. PCR, organizmaların artık canlı olmadığı durumlarda bile kalabilen veya kontaminasyondan kaynaklanabilen mantar DNA'sını tespit etmektedir; bu nedenle moleküler sonuçlar kültür, mikroskopi ve antijen testleri ile birlikte ve standartlaştırılmış tanısal tanımlar çerçevesinde yorumlanmaktadır.