İmmünohistokimya ve Protein Saptama Yöntemleri
İmmünohistokimya (İHK), doku kesitlerindeki proteinleri görünür bir etiketle birleştirilmiş antikorlar kullanarak lokalize eden ve ölçen bir yöntemdir; bu sayede bir gen ürününün nerede ve yarı-kantitatif olarak ne kadar ifade edildiği gösterilmektedir. Transkript kantifikasyonunun protein düzeyindeki karşılığı olarak, tanısal ve moleküler patolojide rutin bir araç olarak kullanılmaktadır.
Tanım
İmmünohistokimya, spesifik proteinleri in situ saptamak için etiketli antikorlar kullanan, hücresel ve hücre altı lokalizasyonlarını görselleştiren ve protein ekspresyonunun yarı-kantitatif bir tahminini sağlayan doku tabanlı bir yöntemdir.
Kapsam
Bu konu, antikor tabanlı saptama prensibini, kalitatif lokalizasyon ile boyama yoğunluğu ve yaygınlığının yarı-kantitatif skorlaması arasındaki farkı, standardizasyon ve kontrollerin önemini ve yöntem örnekleri olarak hormon reseptörü ve HER2 değerlendirmesi gibi iyi bilinen uygulamaları kapsamaktadır. İHK'yı bir ölçüm metodolojisi olarak ele almakta olup, tanısal eşikler veya tedavi yönlendirmesi sağlamamaktadır.
Temel sorular
- Etiketli antikorlar bir doku kesiti içindeki bir proteini nasıl lokalize etmektedir?
- Boyama yarı-kantitatif bir skora nasıl dönüştürülmektedir?
- Kontroller ve standardizasyon, tekrarlanabilir İHK için neden esastır?
- Protein düzeyindeki saptama, transkript kantifikasyonunu nasıl tamamlamaktadır?
Anahtar kavramlar
- Antikor-antijen bağlanması
- Antijen geri kazanımı
- Kromojenik ve floresan saptama
- Yarı-kantitatif skorlama (yoğunluk ve yaygınlık)
- Pozitif ve negatif kontroller
- Pre-analitik fiksasyon etkileri
Mekanizmalar
Birincil bir antikor, sabitlenmiş bir doku kesitindeki hedef antijenine bağlanmaktadır; saptama, antijenin bulunduğu yerde renkli veya floresan bir birikinti üreten ikincil antikorlar ve enzim veya florofor bağlantılı sistemler aracılığıyla güçlendirilmektedir. Fiksasyon ve antijen geri kazanım adımları, epitopların saptanabilir kalıp kalmadığını etkilemektedir, bu nedenle pre-analitik işlemler sonucu güçlü bir şekilde etkilemektedir. Ekspresyon, boyama yoğunluğu ve pozitif hücrelerin oranı değerlendirilerek yarı-kantitatif olarak okunmakta ve genellikle bir skor halinde birleştirilmektedir; bu okuma gözlemciye ve protokole bağlı olduğundan, tekrarlanabilirlik için doğrulanmış kontroller ve standartlaştırılmış prosedürlere ihtiyaç duyulmaktadır. Profesyonel kılavuzlar, reseptör testleri için skorlama ve pre-analitik değişkenlerin nasıl standartlaştırıldığını göstermektedir (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013).
Klinik önem
İHK, doku tanısında ve protein biyobelirteçlerinin raporlanmasında merkezi bir role sahiptir ve yarı-kantitatif doğasını anlamak, patoloji raporlarının yorumlanmasının bir parçasıdır. Bu madde, yöntemi ve standardizasyonunu açıklamaktadır; atıfta bulunulan kılavuzlar, bireysel hastalar için tanısal eşikler veya tedavi kararları sağlamak amacıyla değil, metodolojiyi ve raporlamayı örneklemek üzere referans olarak verilmiştir.
Kanıt ve kılavuzlar
Yarı-kantitatif İHK'nın standardizasyonu, östrojen ve progesteron reseptör testleri (Hammond et al., 2010) ve meme kanserinde HER2 testi (Wolff et al., 2013) için ortak ASCO/CAP kılavuzları ile örneklendirilmektedir; bu kılavuzlar pre-analitik işlemler, skorlama ve kontrol gereksinimlerini tanımlamaktadır. Bunlar burada metodolojik referanslar olarak alıntılanmıştır.
Tarihçe
Antikor tabanlı doku boyama, yirminci yüzyılın ortalarında immünofloresanstan gelişmiş, ardından kalıcı, ışık mikroskopisi ile görülebilen boyamaya olanak tanıyan enzim bağlantılı immünoperoksidaz yöntemleri gelmiştir. Protein biyobelirteçleri patolojide merkezi hale geldikçe, fiksasyon, antijen geri kazanımı ve skorlamanın standartlaştırılmasına odaklanılmış ve bu durum reseptör testleri için konsensüs kılavuzlarında (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013) resmileştirilmiştir.
Tartışmalar
- Yarı-kantitatif İHK skorlaması ne kadar tekrarlanabilirdir?
- Boyama yoğunluğu ve yaygınlığı görsel olarak değerlendirildiği ve fiksasyon ile protokole bağlı olduğu için, sonuçlar gözlemciler ve laboratuvarlar arasında farklılık gösterebilmektedir; tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla standartlaştırılmış pre-analitikler, doğrulanmış kontroller ve tanımlanmış skorlama kriterleri kullanılmaktadır.
Öne çıkan isimler
- M. Elizabeth Hammond
- Antonio Wolff
- D. Craig Allred
İlgili konular
Temel eserler
- hammond-2010
- wolff-2013
Sıkça sorulan sorular
- İmmünohistokimya kantitatif midir?
- İHK en iyi yarı-kantitatif olarak tanımlanmaktadır: kesin bir konsantrasyon üretmek yerine, boyama yoğunluğunu ve pozitif hücrelerin oranını değerlendirerek protein ekspresyonunu tahmin etmektedir; bu nedenle standartlaştırılmış skorlama ve kontroller önemlidir.
- Doku fiksasyonu İHK sonuçlarını neden etkilemektedir?
- Fiksasyon ve sonraki antijen geri kazanım adımı, antikorların bağlandığı epitopları maskeleyebilir veya açığa çıkarabilir, bu nedenle pre-analitik işlemlerdeki farklılıklar boyamayı değiştirebilir ve güvenilir sonuçlar için standartlaştırılması gerekmektedir.