การวินิจฉัยเชื้อราและปรสิตด้วยวิธีโมเลกุล

การวินิจฉัยเชื้อราและปรสิตด้วยวิธีโมเลกุลเป็นการประยุกต์ใช้วิธีการที่อาศัยกรดนิวคลีอิกเพื่อตรวจหาและระบุเชื้อราและปรสิตที่มักจะเจริญเติบโตช้า เพาะเลี้ยงยาก หรือระบุได้ยากด้วยกล้องจุลทรรศน์ การใช้ลำดับเครื่องหมาย (sequence markers) และการตรวจวิเคราะห์แบบเพิ่มปริมาณ (amplification assays) ช่วยขยายขอบเขตการวินิจฉัยในกรณีที่วิธีการแบบดั้งเดิมมีข้อจำกัด

Definition

การวินิจฉัยเชื้อราและปรสิตด้วยวิธีโมเลกุลคือการใช้วิธีการทางโมเลกุล ได้แก่ การเพิ่มปริมาณ (amplification) การผสมพันธุ์ (hybridisation) และการหาลำดับ (sequencing) ของบริเวณเครื่องหมาย (marker regions) เพื่อตรวจหาและระบุเชื้อราและปรสิตในตัวอย่างทางคลินิกหรือเชื้อที่แยกได้

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมถึงการทำ DNA barcoding ของเชื้อรา (โดยเฉพาะบริเวณ internal transcribed spacer), การตรวจหาเชื้อราและปรสิตที่ก่อโรคด้วยวิธี PCR ตลอดจนจุดแข็งและข้อจำกัดของวิธีการเหล่านี้เมื่อเทียบกับการเพาะเลี้ยงและการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ โดยมีกรอบเป็นหัวข้อทางห้องปฏิบัติการและข้อมูลอ้างอิงโดยไม่มีคำแนะนำในการรักษาหรือการให้ยา

Core questions

• มีเชื้อราหรือปรสิตชนิดใดอยู่ และบริเวณเครื่องหมายใดที่ระบุได้ดีที่สุด?
• วิธีการทางโมเลกุลเปรียบเทียบกับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์และการเพาะเลี้ยงในด้านความไวและความจำเพาะอย่างไร?
• เมื่อใดที่การตรวจวิเคราะห์ทางโมเลกุลที่ไม่ต้องอาศัยการเพาะเลี้ยงเพิ่มคุณค่าในการวินิจฉัย?

Key concepts

• บริเวณ ITS เป็นเครื่องหมายบาร์โค้ดของเชื้อรา
• การตรวจหาเชื้อก่อโรคด้วยวิธี PCR
• DNA probes
• แผงตรวจวิเคราะห์โมเลกุลแบบ Multiplex
• การวินิจฉัยที่ไม่ต้องอาศัยการเพาะเลี้ยง
• การเลือกเครื่องหมายและฐานข้อมูลอ้างอิง

Mechanisms

สำหรับเชื้อรา บริเวณ internal transcribed spacer (ITS) ของไรโบโซมในนิวเคลียส (nuclear ribosomal) ทำหน้าที่เป็นบาร์โค้ดสากลที่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวาง ซึ่งเมื่อนำไปหาลำดับและเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลอ้างอิง จะสามารถระบุเชื้อราส่วนใหญ่ได้ถึงระดับสกุลหรือสปีชีส์ (Schoch et al., 2012) การตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธี PCR จะเพิ่มปริมาณเป้าหมายที่จำเพาะต่อสิ่งมีชีวิตเพื่อตรวจหาเชื้อราโดยตรงในวัสดุทางคลินิก ซึ่งอาจมีคุณค่าสำหรับการติดเชื้อแบบรุกราน (invasive disease) ที่การเพาะเลี้ยงทำได้ช้าหรือไม่ไวพอ แม้ว่าความพร้อมทางคลินิกจะแตกต่างกันไปตามสถานการณ์ (Nguyen & Clancy, 2018) สำหรับปรสิต การใช้ DNA probes และ PCR ได้รับการยอมรับตั้งแต่แรกเริ่มว่าเป็นทางเลือกที่ไวต่อการตรวจจับมากกว่าวิธีการแบบดั้งเดิมบางวิธี (Weiss, 1995) และปัจจุบันมีการนำการตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธี PCR และ multiplex assays มาใช้ในการตรวจหาและจำแนกปรสิตในลำไส้และปรสิตอื่นๆ ในห้องปฏิบัติการทางคลินิก (Verweij & Stensvold, 2014)

Clinical relevance

การวินิจฉัยเชื้อราและปรสิตด้วยวิธีโมเลกุลอธิบายว่าห้องปฏิบัติการตรวจหาและระบุสิ่งมีชีวิตที่การเพาะเลี้ยงและการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์อาจตรวจไม่พบได้อย่างไร ซึ่งเป็นข้อมูลสำหรับการรายงานผลการวินิจฉัยและการเฝ้าระวัง หัวข้อนี้อธิบายถึงวิธีการสร้างหลักฐานนี้ และไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดสินใจในการวินิจฉัยหรือการรักษาเฉพาะบุคคล

Epidemiology

การตรวจหาด้วยวิธีโมเลกุลได้ปรับปรุงการรับรู้และการจำแนกการติดเชื้อราและปรสิต โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับสิ่งมีชีวิตที่เพาะเลี้ยงยากหรือจำแนกทางสัณฐานวิทยาได้ยาก ซึ่งสนับสนุนการประเมินการเกิดโรคในระดับประชากรที่แม่นยำยิ่งขึ้น (Verweij & Stensvold, 2014; Weiss, 1995)

Evidence & guidelines

การระบุเชื้อราโดยอาศัยเครื่องหมาย (marker-based) ขึ้นอยู่กับงานของกลุ่มนักวิจัยที่กำหนดให้บริเวณ ITS เป็นบาร์โค้ดสากล (Schoch et al., 2012) ในขณะที่บทความทบทวนได้สรุปประสิทธิภาพทางคลินิกและข้อจำกัดของการตรวจวิเคราะห์เชื้อราและปรสิตด้วยวิธี PCR (Nguyen & Clancy, 2018; Verweij & Stensvold, 2014) มาตรฐานเฉพาะสำหรับการตรวจวิเคราะห์ถูกกำหนดโดยองค์กรวิชาชีพและผู้ผลิต และไม่ได้นำมากล่าวซ้ำในที่นี้

History

วิธีการทางโมเลกุลได้เข้ามาในสาขาจุลชีววิทยาเชื้อราและปรสิตวิทยาเมื่อ PCR และการตรวจหาด้วยโพรบแสดงให้เห็นความไวที่สูงกว่าเทคนิคดั้งเดิมบางอย่าง (Weiss, 1995) การยอมรับอย่างเป็นทางการของบริเวณ ITS เป็นบาร์โค้ดสากลของเชื้อราได้ทำให้การระบุเชื้อราด้วยวิธีโมเลกุลเป็นมาตรฐาน (Schoch et al., 2012) และการตรวจวิเคราะห์ปรสิตวิทยาด้วยวิธี PCR ก็ได้ถูกนำมาใช้ในห้องปฏิบัติการทางคลินิกเป็นประจำมากขึ้น (Verweij & Stensvold, 2014)

Debates

การตรวจวิเคราะห์เชื้อราด้วยวิธีโมเลกุลพร้อมที่จะเข้ามาแทนที่การวินิจฉัยแบบดั้งเดิมแล้วหรือยัง?

การตรวจวิเคราะห์เชื้อราด้วยวิธี PCR สามารถเพิ่มความไวและความรวดเร็วสำหรับการติดเชื้อแบบรุกรานได้ แต่ความแปรปรวนในการกำหนดมาตรฐานและการตรวจสอบทางคลินิกหมายความว่ามักจะใช้เพื่อเสริมมากกว่าที่จะทดแทนการเพาะเลี้ยงและการตรวจหาแอนติเจน

Seminal works

• schoch-2012
• weiss-1995
• verweij-2014

Frequently asked questions

เหตุใดจึงใช้บริเวณ ITS ในการระบุเชื้อรา?

บริเวณ internal transcribed spacer มีคุณสมบัติที่อนุรักษ์ไว้มากพอที่จะสามารถเพิ่มปริมาณได้ในเชื้อราหลายชนิด และมีความแปรปรวนมากพอที่จะจำแนกสปีชีส์ได้หลายชนิด ซึ่งนำไปสู่การยอมรับว่าเป็นบาร์โค้ด DNA สากลของเชื้อรา

วิธีการทางโมเลกุลเข้ามาแทนที่การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์และการเพาะเลี้ยงสำหรับปรสิตหรือไม่?

วิธีการทางโมเลกุลมักจะเพิ่มความไวและความสามารถในการจำแนกสปีชีส์ แต่โดยทั่วไปแล้วจะใช้ควบคู่ไปกับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์และวิธีการอื่นๆ มากกว่าที่จะเป็นการทดแทนทั้งหมด ขึ้นอยู่กับสิ่งมีชีวิตและบริบททางคลินิก