ฟลูออเรสเซนซ์อินซิทูไฮบริไดเซชัน (FISH)

ฟลูออเรสเซนซ์อินซิทูไฮบริไดเซชัน (Fluorescence in situ hybridization - FISH) เป็นเทคนิคทางเซลล์พันธุศาสตร์ระดับโมเลกุลที่ใช้ดีเอ็นเอโพรบติดฉลากเรืองแสงเพื่อจับกับลำดับโครโมโซมจำเพาะ ซึ่งจะถูกมองเห็นได้โดยตรงบนโครโมโซมหรือในนิวเคลียสของเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ ด้วยการกำหนดเป้าหมายไปยังตำแหน่งจำเพาะแทนที่จะสแกนทั้งจีโนม FISH สามารถตรวจจับและระบุตำแหน่งของการขาดหาย การเพิ่มจำนวน การจัดเรียงใหม่ และความผิดปกติของจำนวนโครโมโซม (aneuploidies) ที่จำเพาะได้อย่างมีความไวสูง รวมถึงในเซลล์ที่ไม่แบ่งตัว (interphase)

Definition

FISH เป็นเทคนิคที่ใช้โพรบนิวคลีอิกแอซิดที่ติดฉลากมาไฮบริไดซ์กับลำดับที่เข้าคู่กันซึ่งถูกตรึงอยู่บนสไลด์โครโมโซมหรือนิวเคลียสของเซลล์ และตรวจจับด้วยฟลูออเรสเซนซ์ ทำให้สามารถระบุ นับ หรือระบุตำแหน่งของเป้าหมายทางจีโนมที่จำเพาะได้

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมหลักการของการไฮบริไดเซชันของโพรบ ชนิดหลักของโพรบและการใช้งาน (โพรบจำเพาะตำแหน่ง, โพรบเซนโทรเมียร์, และโพรบย้อมสีโครโมโซมทั้งแท่ง) และการประยุกต์ใช้ FISH กับเซลล์ระยะเมตาเฟสและอินเตอร์เฟส เป็นข้อมูลอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัยและไม่ได้ให้คำแนะนำในการจัดการทางคลินิก

Core questions

• โพรบที่ติดฉลากสามารถจับกับเป้าหมายโครโมโซมได้อย่างจำเพาะเจาะจงและตรวจจับได้ด้วยวิธีใด?
• อะไรคือความแตกต่างระหว่างโพรบจำเพาะตำแหน่ง โพรบเซนโทรเมียร์ และโพรบย้อมสีโครโมโซมทั้งแท่ง?
• เหตุใด FISH จึงสามารถนำไปใช้กับเซลล์ระยะอินเตอร์เฟสได้เช่นเดียวกับเซลล์ระยะเมตาเฟส?
• ความผิดปกติที่จำเพาะเจาะจงใดบ้างที่ FISH สามารถแก้ไขได้ซึ่งการทำแถบสีไม่สามารถทำได้?

Key concepts

• การไฮบริไดเซชันของกรดนิวคลีอิก
• โพรบติดฉลากเรืองแสง
• โพรบจำเพาะตำแหน่ง
• โพรบเซนโทรเมียร์ (alpha-satellite)
• โพรบย้อมสีโครโมโซมทั้งแท่ง
• FISH ในระยะอินเตอร์เฟสเทียบกับระยะเมตาเฟส
• ความจำเพาะของโพรบและการนับสัญญาณ
• การตรวจจับ microdeletion

Mechanisms

ดีเอ็นเอโพรบที่เข้าคู่กับลำดับเป้าหมายจะถูกติดฉลากด้วยฟลูออโรฟอร์ (โดยตรงหรือผ่านโมเลกุลรายงาน) ดีเอ็นเอโครโมโซมเป้าหมายบนสไลด์และโพรบจะถูกทำให้เสียสภาพเป็นสายเดี่ยว จากนั้นจึงปล่อยให้เกิดการจับคู่กัน (anneal) เพื่อให้โพรบไฮบริไดซ์กับลำดับที่เข้าคู่กันในตำแหน่ง หลังจากล้างโพรบที่ไม่จับออกไป สัญญาณที่จับอยู่จะถูกมองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ การออกแบบโพรบที่แตกต่างกันมีวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกัน: โพรบจำเพาะตำแหน่ง (locus-specific probes) ใช้ตรวจจับหรือยืนยันการเพิ่มขึ้น การสูญหาย หรือการจัดเรียงใหม่ที่ยีนหรือบริเวณที่กำหนด; โพรบเซนโทรเมียร์ (centromeric probes) ใช้เพื่อนับจำนวนสำเนาของโครโมโซมที่กำหนด (การนับความผิดปกติของจำนวนโครโมโซม); และโพรบย้อมสีโครโมโซมทั้งแท่ง (whole-chromosome paint probes) ใช้ติดฉลากโครโมโซมทั้งแท่งเพื่อระบุลักษณะการจัดเรียงใหม่ที่ซับซ้อน เนื่องจากการไฮบริไดเซชันไม่จำเป็นต้องใช้เซลล์ที่กำลังแบ่งตัว FISH จึงสามารถทำได้กับนิวเคลียสระยะอินเตอร์เฟส ซึ่งช่วยขยายการวิเคราะห์ไปยังเนื้อเยื่อและตัวอย่างที่ยากต่อการเตรียมเซลล์ระยะเมตาเฟส

Clinical relevance

FISH ใช้เพื่อยืนยันหรือแยกแยะภาวะ microdeletion และ microduplication ที่จำเพาะ เพื่อระบุจำนวนความผิดปกติของจำนวนโครโมโซม และเพื่อตรวจจับการจัดเรียงใหม่ที่จำเพาะ เช่นที่พบในมะเร็งบางชนิด เทคนิคนี้ช่วยเสริมการทำคาริโอไทป์โดยเพิ่มการตรวจจับที่จำเพาะเจาะจงและมีความไวสูง รวมถึงในเซลล์ระยะอินเตอร์เฟส ข้อมูลนี้อธิบายถึงวิธีการสร้างผลลัพธ์ FISH ไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดสินใจในการวินิจฉัยหรือการรักษาเฉพาะบุคคล

Evidence & guidelines

ผลลัพธ์ FISH ได้รับการอธิบายภายใต้ระบบการตั้งชื่อเซลล์พันธุศาสตร์มนุษย์ระหว่างประเทศ (International System for Human Cytogenomic Nomenclature - ISCN) ซึ่งรวมถึงสัญกรณ์สำหรับสัญญาณโพรบและผลการไฮบริไดเซชัน

History

การไฮบริไดเซชันอินซิทูได้รับการพัฒนาครั้งแรกด้วยโพรบกัมมันตรังสีในช่วงปลายทศวรรษ 1960 การเปลี่ยนมาใช้การตรวจจับด้วยฟลูออเรสเซนซ์ ซึ่งแสดงให้เห็นเชิงปริมาณโดย Pinkel, Straume, และ Gray ในปี 1986 ทำให้ได้วิธีการที่รวดเร็ว ปลอดภัย และสามารถใช้หลายสีได้ และเป็นจุดเริ่มต้นของเซลล์พันธุศาสตร์ระดับโมเลกุล การออกแบบโพรบและการใช้หลายสีในภายหลังได้ขยายขอบเขตของ FISH จากการตรวจจับตำแหน่งเดียวไปสู่การวิเคราะห์เป้าหมายหลายอย่างพร้อมกัน ซึ่งเชื่อมโยงเซลล์พันธุศาสตร์แบบดั้งเดิมและพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุลเข้าด้วยกัน

Key figures

• Daniel Pinkel
• Joe W. Gray
• Michael Speicher
• Nigel Carter

Seminal works

• pinkel-1986
• speicher-carter-2005

Frequently asked questions

FISH แตกต่างจากการทำคาริโอไทป์อย่างไร?

การทำคาริโอไทป์จะสแกนจีโนมทั้งหมดด้วยความละเอียดต่ำและเผยให้เห็นการจัดเรียงใหม่ที่สมดุลและจำนวนชุดโครโมโซม (ploidy) ในขณะที่ FISH ใช้โพรบที่ติดฉลากเพื่อตรวจสอบตำแหน่งจำเพาะด้วยความไวสูง รวมถึงในเซลล์ระยะอินเตอร์เฟสที่ไม่แบ่งตัว ทั้งสองเป็นแนวทางที่เสริมซึ่งกันและกัน

สามารถทำ FISH โดยไม่ต้องใช้เซลล์ที่กำลังแบ่งตัวได้หรือไม่?

ได้ เนื่องจากกระบวนการไฮบริไดเซชันไม่ขึ้นอยู่กับการควบแน่นของโครโมโซม FISH จึงสามารถนำไปใช้กับนิวเคลียสระยะอินเตอร์เฟสได้ ทำให้สามารถวิเคราะห์ตัวอย่างที่ยากต่อการเตรียมโครโมโซมระยะเมตาเฟส