กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลและฟลูออเรสเซนซ์

กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์สร้างภาพตัวอย่างโดยการกระตุ้นโมเลกุลเรืองแสงและรวบรวมแสงที่มีความยาวคลื่นยาวกว่าที่ปล่อยออกมา ทำให้ได้ภาพเซลล์ที่มีความคมชัดสูงและจำเพาะเจาะจงในระดับโมเลกุล กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเพิ่มรูเข็มที่ปฏิเสธแสงที่อยู่นอกโฟกัส ทำให้เกิดภาพตัดขวางเชิงแสงที่คมชัดซึ่งสามารถนำมาประกอบกันเป็นภาพสามมิติของเซลล์ได้

Definition

กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ใช้การดูดกลืนและการปล่อยแสงซ้ำโดยฟลูออโรฟอร์ (fluorophores) เพื่อสร้างภาพโครงสร้างที่ติดฉลากไว้ ส่วนกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นเทคนิคฟลูออเรสเซนซ์ที่ใช้รูเข็มเพื่อกันแสงที่อยู่นอกโฟกัสออกไป ทำให้มีเพียงระนาบที่อยู่ในโฟกัสบางๆ เท่านั้นที่สร้างภาพแต่ละภาพ ทำให้ได้ภาพตัดขวางเชิงแสง

Scope

เนื้อหานี้ครอบคลุมหลักการของความเปรียบต่างฟลูออเรสเซนซ์ ข้อดีของการสร้างภาพแบบคอนโฟคอลที่สามารถตัดแสงได้ และวิธีการความละเอียดสูงพิเศษที่ผลักดันการสร้างภาพฟลูออเรสเซนซ์ให้ต่ำกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบน โดยถือว่าสิ่งเหล่านี้เป็นวิธีการสร้างภาพในชีววิทยาของเซลล์ ไม่ใช่คำแนะนำทางคลินิก

Core questions

• ฟลูออเรสเซนซ์ให้ความเปรียบต่างระดับโมเลกุลในเซลล์ได้อย่างไร?
• รูเข็มคอนโฟคอลสร้างภาพตัดขวางเชิงแสงได้อย่างไร?
• ภาพสามมิติของเซลล์ถูกสร้างขึ้นใหม่ได้อย่างไร?
• วิธีการความละเอียดสูงพิเศษเกินขีดจำกัดการเลี้ยวเบนได้อย่างไร?

Key concepts

• การกระตุ้นและการปล่อยแสงฟลูออเรสเซนซ์
• ฟลูออโรฟอร์และโปรตีนเรืองแสง
• รูเข็มคอนโฟคอลและการตัดแสงเชิงแสง
• การสร้างภาพสามมิติขึ้นใหม่
• การฟอกจางด้วยแสง (Photobleaching) และความเป็นพิษต่อแสง (Phototoxicity)
• การสร้างภาพความละเอียดสูงพิเศษ (ไม่จำกัดการเลี้ยวเบน)

Mechanisms

ในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ ฟลูออโรฟอร์จะดูดกลืนแสงกระตุ้นและปล่อยแสงออกมาใหม่ที่ความยาวคลื่นที่ยาวกว่า ซึ่งถูกแยกออกจากแสงกระตุ้นด้วยฟิลเตอร์เพื่อให้ได้ความเปรียบต่างที่สว่างและจำเพาะเจาะจงบนพื้นหลังที่มืด ดังที่ Lichtman และ Conchello ได้ทบทวนไว้ อย่างไรก็ตาม ภาพฟลูออเรสเซนซ์แบบดั้งเดิมจะมีแสงพร่ามัวจากด้านบนและด้านล่างของระนาบโฟกัส กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจะวางรูเข็มให้สอดคล้องกับจุดโฟกัส เพื่อให้แสงที่อยู่นอกโฟกัสถูกปฏิเสธ ทำให้เกิดภาพตัดขวางเชิงแสงที่ Conchello และ Lichtman อธิบายไว้ ซึ่งสามารถซ้อนกันเป็นสามมิติได้ เนื่องจากการปล่อยแสง เช่นเดียวกับกล้องจุลทรรศน์แสงทั้งหมด ยังคงอยู่ภายใต้ขีดจำกัดการเลี้ยวเบน วิธีการความละเอียดสูงพิเศษ เช่น กล้องจุลทรรศน์แบบกระตุ้นการปล่อยแสงที่ลดลง (stimulated-emission-depletion microscopy) ที่ Hell และ Wichmann นำเสนอ ได้จัดการกระบวนการฟลูออเรสเซนซ์เองเพื่อแยกรายละเอียดที่ต่ำกว่าขีดจำกัดนั้นมาก ดังที่ Schermelleh และคณะได้สำรวจไว้

Clinical relevance

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลและฟลูออเรสเซนซ์ถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในพยาธิวิทยา จักษุวิทยา และการวิจัยทางชีวการแพทย์ เพื่อระบุตำแหน่งของโมเลกุลและสร้างภาพเนื้อเยื่อในสามมิติ เนื้อหานี้อธิบายหลักการสร้างภาพที่เกี่ยวข้อง และมีวัตถุประสงค์เพื่อการศึกษาอ้างอิง ไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการวินิจฉัยหรือการตัดสินใจในการรักษาเฉพาะบุคคล

History

หลักการคอนโฟคอลถูกคิดค้นโดย Marvin Minsky ในทศวรรษ 1950 แต่กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์ที่ใช้งานได้จริง และฟลูออโรฟอร์สังเคราะห์และที่เข้ารหัสทางพันธุกรรมที่สว่าง ทำให้การสร้างภาพฟลูออเรสเซนซ์มีบทบาทสำคัญในชีววิทยาของเซลล์ตั้งแต่ปลายศตวรรษที่ 20 การทำลายขีดจำกัดการเลี้ยวเบนในเวลาต่อมาด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบกระตุ้นการปล่อยแสงที่ลดลง (Hell & Wichmann, 1994) และเทคนิคที่เกี่ยวข้อง ได้เปิดยุคของการสร้างภาพฟลูออเรสเซนซ์ความละเอียดสูงพิเศษ ซึ่งสรุปโดย Schermelleh และคณะ

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

รูเข็มคอนโฟคอลทำหน้าที่อะไร?

มันถูกจัดวางเพื่อให้แสงจากภายนอกระนาบโฟกัสถูกปิดกั้น เหลือเพียงแสงที่อยู่ในโฟกัสเท่านั้นที่สร้างภาพ ซึ่งจะสร้างภาพตัดขวางเชิงแสงที่บางเฉียบที่สามารถนำมารวมกับภาพอื่นๆ เพื่อสร้างมุมมองสามมิติได้

กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์สามารถเอาชนะขีดจำกัดการเลี้ยวเบนได้อย่างไร?

วิธีการความละเอียดสูงพิเศษ เช่น กล้องจุลทรรศน์แบบกระตุ้นการปล่อยแสงที่ลดลง จะควบคุมกระบวนการปล่อยแสงฟลูออเรสเซนซ์เพื่อให้สามารถแยกรายละเอียดที่ต่ำกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบนแบบคลาสสิกได้มาก