ฟลูออเรสเซนซ์อินซิทูไฮบริไดเซชัน (FISH) ในเซลล์วิทยา

ฟลูออเรสเซนซ์อินซิทูไฮบริไดเซชัน (FISH) ใช้ดีเอ็นเอโพรบที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงซึ่งจับกับลำดับที่เข้าคู่กันในนิวเคลียสของเซลล์ ทำให้สามารถมองเห็นบริเวณโครโมโซมหรือยีนที่จำเพาะภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ เมื่อนำมาใช้กับสิ่งส่งตรวจทางเซลล์วิทยา เทคนิคนี้สามารถตรวจจับภาวะแอนยูพลอยดี (aneuploidy), การเพิ่มจำนวนยีน (gene amplifications), การขาดหายไป (deletions) และการจัดเรียงใหม่ (rearrangements) ได้โดยตรงในเซลล์ที่สมบูรณ์ เพิ่มมิติทางเซลล์พันธุกรรมให้กับการประเมินทางสัณฐานวิทยา

Definition

FISH เป็นเทคนิคเสริมทางเซลล์พันธุกรรมที่ใช้โพรบกรดนิวคลีอิกที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงเพื่อไฮบริไดซ์กับเป้าหมายดีเอ็นเอจำเพาะภายในเซลล์บนสิ่งส่งตรวจทางเซลล์วิทยา ทำให้สามารถมองเห็นการเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนาโครโมโซมและการจัดเรียงโครงสร้างได้

Scope

บทความนี้ครอบคลุมหลักการของการไฮบริไดเซชันของโพรบบนสิ่งส่งตรวจทางเซลล์วิทยา ชนิดของความผิดปกติทางจีโนมที่ FISH สามารถแก้ไขได้ และการประยุกต์ใช้ทางเซลล์วิทยาที่เป็นที่ยอมรับ เช่น การทดสอบแบบหลายเป้าหมายในสิ่งส่งตรวจปัสสาวะและหลอดลม เป็นข้อมูลอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัยและไม่ได้ให้โปรโตคอลการทดสอบหรือการแปลผล

Core questions

• FISH สามารถแก้ไขความผิดปกติระดับโครโมโซมหรือยีนชนิดใดได้บ้างในสิ่งส่งตรวจทางเซลล์วิทยาที่กำหนด?
• การออกแบบโพรบและเกณฑ์การนับสัญญาณกำหนดผลบวกได้อย่างไร?
• FISH เสริมสัณฐานวิทยาทางเซลล์วิทยาในตัวอย่างที่คลุมเครือหรือไม่ชัดเจนได้อย่างไร?

Key concepts

• การไฮบริไดเซชันของโพรบจำเพาะลำดับ
• โพรบเซนโทรเมียร์, โพรบจำเพาะตำแหน่ง, และโพรบแบบแยกส่วน
• การตรวจจับภาวะแอนยูพลอยดีและการเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนา
• แผงโพรบหลายเป้าหมาย (เช่น UroVysion)
• การนับสัญญาณและเกณฑ์การให้คะแนน
• การประยุกต์ใช้กับเซลล์ที่สมบูรณ์บนสไลด์

Mechanisms

ดีเอ็นเอโพรบสายเดี่ยวที่ถูกทำให้เสียสภาพ (denatured single-stranded probe DNA) ซึ่งมีฟลูออโรฟอร์ (fluorophore) เป็นตัวนำ จะจับคู่กับลำดับเป้าหมายที่เข้าคู่กันภายในดีเอ็นเอในนิวเคลียสของเซลล์ที่ถูกตรึงบนสไลด์ หลังจากล้างโพรบที่ไม่จับออกไป สัญญาณที่จับได้จะถูกนับภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ โพรบเซนโทรเมียร์ (centromeric probes) รายงานจำนวนสำเนาโครโมโซม โพรบจำเพาะตำแหน่ง (locus-specific probes) ตรวจจับการเพิ่มจำนวนหรือการขาดหายไปของบริเวณ และโพรบแบบแยกส่วนสองสี (dual-colour break-apart probes) เผยให้เห็นการจัดเรียงใหม่โดยการแยกสัญญาณที่จับคู่กัน แผงโพรบหลายเป้าหมาย (multitarget panels) รวมโพรบหลายชนิดเข้าด้วยกันเพื่อให้สามารถจดจำรูปแบบแอนยูพลอยดีที่เป็นลักษณะเฉพาะของมะเร็งในเซลล์ที่มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่คลุมเครือได้

Clinical relevance

FISH เพิ่มข้อมูลทางเซลล์พันธุกรรมที่เป็นวัตถุประสงค์ให้กับการตรวจทางเซลล์วิทยา ตัวอย่างเช่น ช่วยในการประเมินตัวอย่างเซลล์เยื่อบุทางเดินปัสสาวะที่ผิดปกติ หรือประเมินเซลล์วิทยาปอด และใช้เป็นส่วนเสริมมากกว่าการทดแทนการตรวจทางสัณฐานวิทยา บทความนี้อธิบายว่าวิธีการสร้างข้อมูลอย่างไร การเลือกและการแปลผลการทดสอบที่จำเพาะเป็นการตัดสินใจของห้องปฏิบัติการและทางคลินิก และไม่ใช่คำแนะนำเฉพาะบุคคล

Evidence & guidelines

การศึกษาแบบจับคู่ตัวอย่างของการทดสอบ UroVysion แบบหลายเป้าหมายในปัสสาวะที่ขับถ่ายออกมา ได้เปรียบเทียบประสิทธิภาพกับการตรวจเซลล์วิทยาแบบดั้งเดิมสำหรับการตรวจหามะเร็งเยื่อบุทางเดินปัสสาวะ โดยรายงานจุดแข็งและข้อจำกัดที่เสริมกัน (Lavery et al., 2017; Dimashkieh et al., 2013) FISH แบบหลายเป้าหมายยังได้รับการประเมินในสิ่งส่งตรวจเซลล์วิทยาหลอดลมสำหรับการตรวจหามะเร็งปอด (Zhai et al., 2015)

History

การไฮบริไดเซชันอินซิทูได้รับการพัฒนาครั้งแรกสำหรับเนื้อเยื่อและการเตรียมโครโมโซม การแทนที่ฉลากกัมมันตรังสีด้วยฉลากฟลูออเรสเซนต์ทำให้การทดสอบแบบหลายสีและหลายโพรบเป็นไปได้ในทางปฏิบัติ และช่วยให้สามารถนำเทคนิคนี้ไปใช้โดยตรงกับสไลด์เซลล์วิทยา แผงปัสสาวะแบบหลายเป้าหมายกลายเป็นหนึ่งในการประยุกต์ใช้ทางเซลล์วิทยาที่ได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางที่สุด

Debates

ควรใช้ FISH และเซลล์วิทยาแบบดั้งเดิมร่วมกันอย่างไรในตัวอย่างปัสสาวะที่ผิดปกติ?

การศึกษาแสดงให้เห็นว่า FISH และเซลล์วิทยามีความไวและความจำเพาะที่เสริมกัน ทำให้เกิดคำถามว่า FISH ควรใช้เป็นการทดสอบแบบรีเฟล็กซ์ (reflex test), เป็นส่วนเสริมของสัณฐานวิทยา, หรือเป็นเครื่องมือคัดกรอง โดยยังไม่มีแนวทางเดียวที่ได้รับการยอมรับในระดับสากล

Seminal works

• dimashkieh-2013
• lavery-2017

Frequently asked questions

FISH สามารถตรวจจับความผิดปกติชนิดใดได้บ้างในตัวอย่างทางเซลล์วิทยา?

FISH สามารถเผยให้เห็นภาวะแอนยูพลอยดีของโครโมโซม, การเพิ่มจำนวนและการขาดหายไปของยีน, และการจัดเรียงโครงสร้างใหม่ โดยการนับสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของโพรบในนิวเคลียสของเซลล์แต่ละเซลล์บนสไลด์

FISH ใช้แทนเซลล์วิทยาแบบดั้งเดิมหรือไม่?

ไม่; ใช้เป็นส่วนเสริม FISH และเซลล์วิทยาสัณฐานวิทยามีจุดแข็งที่เสริมกัน และ FISH เพิ่มข้อมูลทางเซลล์พันธุกรรมมากกว่าการทดแทนการประเมินเซลล์ด้วยสายตา