ПЦР и амплификация нуклеиновых кислот

Полимеразная цепная реакция — циклический, праймер-направленный метод, который экспоненциально копирует выбранный сегмент ДНК, — и более широкое семейство методов амплификации, основанных на нем.

Definition

Полимеразная цепная реакция — это метод in vitro, который экспоненциально амплифицирует определенную область ДНК путем повторяющихся циклов разделения цепей, отжига фланкирующих праймеров и элонгации с помощью термостабильной ДНК-полимеразы; амплификация нуклеиновых кислот в более широком смысле охватывает связанные методы копирования последовательностей ДНК или РНК.

Scope

Эта тема охватывает принципы и варианты амплификации нуклеиновых кислот: термическое циклирование денатурации, отжига праймеров и элонгации, которое определяет полимеразную цепную реакцию; роль праймеров и термостабильной полимеразы; а также расширения, такие как обратная транскрипция и количественная амплификация в реальном времени. В ней рассматривается метод и его логика; секвенирование и клонирование с использованием амплифицированной ДНК рассматриваются в сопутствующих темах.

Core questions

• Как повторяющиеся циклы нагревания и охлаждения амплифицируют специфическую область ДНК?
• Почему два праймера и термостабильная полимераза являются необходимыми?
• Как амплификация становится экспоненциальной?
• Как метод расширяется для количественного определения нуклеиновых кислот или для амплификации РНК?

Key theories

Экспоненциальная амплификация, определяемая праймерами

Пара праймеров, фланкирующих мишень, определяет амплифицируемую область, и поскольку каждая новая цепь служит матрицей в следующем цикле, количество копий мишени примерно удваивается за цикл, увеличиваясь экспоненциально.

Термостабильная полимераза обеспечивает циклирование

Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволяет многократно проводить денатурацию при высокой температуре без повторного добавления фермента, что делает автоматическое термическое циклирование практичным, а реакцию — надежной.

Mechanisms

Каждый цикл нагревает образец для разделения цепей ДНК, охлаждает его, чтобы два праймера отожглись на последовательностях, фланкирующих мишень на противоположных цепях, и нагревает до температуры элонгации, при которой термостабильная полимераза синтезирует новые цепи из праймеров. Поскольку продукты одного цикла служат матрицей для следующего, целевая область экспоненциально амплифицируется в течение многих циклов. Варианты включают амплификацию с обратной транскрипцией, которая сначала копирует РНК в ДНК, и количественную амплификацию в реальном времени, которая отслеживает накопление продукта для измерения исходных количеств.

Clinical relevance

Амплификация занимает центральное место в генетическом тестировании, обнаружении патогенов и судебно-медицинской идентификации; представлена как значимость, а не как клиническое руководство.

History

Муллис разработал полимеразную цепную реакцию в начале 1980-х годов, а отчет Сайки и коллег 1985 года продемонстрировал ее использование, при этом последующее внедрение термостабильной полимеразы сделало ее рутинной; изобретение было отмечено Нобелевской премией по химии 1993 года.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

Почему ПЦР нужны праймеры?

Праймеры определяют начальные точки синтеза на каждой цепи, поэтому они определяют, какая область будет копироваться, и позволяют полимеразе начать элонгацию.

Что делает амплификацию экспоненциальной?

Новые цепи каждого цикла становятся матрицами в следующем цикле, поэтому количество копий мишени примерно удваивается в каждом цикле.