Секвенирование ДНК

Как определяется порядок оснований в ДНК — от метода обрыва цепи Сэнгера до массово-параллельных технологий, считывающих целые геномы.

Definition

Секвенирование ДНК — это определение точного порядка нуклеотидов в молекуле ДНК, исторически достигаемое путем синтеза с обрывом цепи, а в настоящее время преимущественно с помощью массово-параллельных методов, которые считывают множество фрагментов одновременно.

Scope

Эта тема охватывает методы считывания нуклеотидной последовательности ДНК: метод обрыва цепи (Сэнгера) и его принцип специфического для оснований обрыва, а также высокопроизводительные, массово-параллельные подходы, которые пришли ему на смену и сделали секвенирование в геномном масштабе рутинным. В ней рассматривается логика секвенирования; амплификация и клонирование, подготавливающие ДНК к секвенированию, рассматриваются в сопутствующих темах.

Core questions

• Как секвенирование с обрывом цепи выявляет порядок оснований?
• Почему меченые дидезоксинуклеотиды сделали секвенирование практичным?
• Как массово-параллельные методы масштабируют секвенирование до целых геномов?
• Как короткие прочтения собираются в более длинные последовательности и геномы?

Key theories

Секвенирование с обрывом цепи

Синтез в присутствии дидезоксинуклеотидов, обрывающих цепь, производит набор фрагментов, заканчивающихся на каждом вхождении данного основания, и упорядочивание их по длине выявляет последовательность, как было предложено Сэнгером и его коллегами.

Массово-параллельное секвенирование

Одновременное считывание огромного количества фрагментов ДНК и вычислительная реконструкция последовательности значительно снизили стоимость и повысили пропускную способность, сделав возможным рутинное секвенирование в геномном масштабе.

Mechanisms

При секвенировании с обрывом цепи праймер удлиняется вдоль матрицы в присутствии нормальных нуклеотидов плюс небольшой доли дидезоксинуклеотидов, которые, будучи включенными, останавливают синтез; результатом является вложенный набор фрагментов, концевое основание которых известно, которые разделяются по размеру для считывания последовательности. Современные массово-параллельные платформы иммобилизуют и амплифицируют множество фрагментов матрицы и одновременно детектируют включение оснований во всех из них, генерируя большое количество коротких прочтений, которые программное обеспечение выравнивает или собирает в полную последовательность.

Clinical relevance

Секвенирование лежит в основе генетической диагностики, геномики рака, эпиднадзора за патогенами и персонализированных подходов к медицине; представлено как значимость, а не как клиническое руководство.

History

Метод обрыва цепи Сэнгера и параллельный химический метод Максама-Гилберта, оба разработанные в 1970-х годах, сделали секвенирование ДНК осуществимым и принесли Нобелевскую премию; появление массово-параллельных технологий в 2000-х годах снизило затраты на порядки и ознаменовало наступление геномной эры.

Key figures

• Frederick Sanger
• Walter Gilbert

Seminal works

• sanger1977
• lodish2016

Frequently asked questions

Что такое дидезоксинуклеотид и почему он используется в секвенировании?

Это модифицированный нуклеотид, который, будучи добавленным, останавливает дальнейший синтез; его включение в случайные позиции генерирует фрагменты, заканчивающиеся на каждом основании, что позволяет выявить последовательность.

Как сейчас можно так быстро секвенировать целые геномы?

Массово-параллельные платформы считывают миллионы фрагментов ДНК одновременно и используют программное обеспечение для их сборки, значительно увеличивая скорость и снижая стоимость по сравнению с более ранними методами.