Рекомбинантная ДНК и молекулярное клонирование

Как рестриктазы, лигазы и векторы используются для разрезания и соединения ДНК из разных источников и ее размножения в клетках-хозяевах — основополагающая технология генной инженерии.

Definition

Рекомбинантная ДНК и молекулярное клонирование — это совокупность методов соединения фрагментов ДНК из разных источников в вектор и размножения полученной молекулы в клетках-хозяевах, чтобы выбранная последовательность ДНК могла быть амплифицирована, сохранена и изучена.

Scope

Эта тема охватывает конструирование рекомбинантной ДНК и ее клонирование: рестриктазы и разрезание ДНК в специфических сайтах, соединение фрагментов с помощью ДНК-лигазы, использование плазмидных и других векторов, введение в клетки-хозяева и отбор рекомбинантов. В ней рассматриваются принципы клонирования; последующая амплификация, секвенирование и редактирование рассматриваются в сопутствующих темах.

Core questions

• Как рестриктазы разрезают ДНК в специфических последовательностях?
• Как фрагменты ДНК соединяются в вектор?
• Что такое векторы и как они переносят чужеродную ДНК в клетки-хозяева?
• Как отбираются клетки, несущие желаемую рекомбинантную молекулу?

Key theories

Последовательно-специфическое разрезание и соединение

Рестриктазы распознают и разрезают определенные последовательности ДНК, часто оставляя комплементарные концы, которые ДНК-лигаза может соединять, позволяя предсказуемо рекомбинировать фрагменты из разных источников.

Векторное размножение

Введение фрагмента в реплицирующийся вектор и его внедрение в клетки-хозяева позволяет копировать рекомбинантную ДНК вместе с хозяином, что дает множество идентичных клонов выбранной последовательности.

Mechanisms

Рестриктаза разрезает как целевую ДНК, так и вектор в специфических сайтах узнавания, часто генерируя соответствующие одноцепочечные выступающие концы. Фрагменты смешиваются и соединяются ДНК-лигазой для образования рекомбинантной молекулы, которая вводится в клетки-хозяева путем трансформации или связанных методов. Поскольку вектор несет точку начала репликации и селективные маркеры, клетки-хозяева, которые поглощают и поддерживают рекомбинантную ДНК, могут быть идентифицированы и выращены, производя большое количество клонированной последовательности для дальнейшего использования.

Clinical relevance

Молекулярное клонирование лежит в основе производства рекомбинантных белков, таких как инсулин и антитела, а также конструирования векторов для генной терапии и вакцин; представлено как значимость, а не как клиническое руководство.

History

Характеристика рестриктаз Арбером, Смитом и Натансом, а также конструирование первых молекул рекомбинантной ДНК Бергом, Коэном и Бойером в начале 1970-х годов, заложили основы молекулярного клонирования и принесли Нобелевское признание, сделав генную инженерию рутинной практикой.

Key figures

• Hamilton Smith
• Daniel Nathans
• Werner Arber
• Paul Berg
• Herbert Boyer
• Stanley Cohen

Seminal works

• smith1970
• watson2013

Frequently asked questions

Что делает рестриктаза?

Она распознает специфическую короткую последовательность ДНК и разрезает ДНК в этом месте, часто оставляя концы, которые могут быть соединены с другими фрагментами, разрезанными тем же ферментом.

Почему векторы необходимы при клонировании?

Вектор переносит вставленную ДНК в клетки-хозяева и реплицируется там, так что клонированная последовательность копируется и может быть отобрана и размножена.