Секвенирование и сборка генома

Чтение генома означает определение порядка его миллиардов оснований, что секвенаторы делают только короткими фрагментами, оставляя программному обеспечению задачу реконструкции полной последовательности путем поиска перекрывающихся участков этих фрагментов.

Definition

Секвенирование генома — это экспериментальное определение нуклеотидного порядка ДНК организма, а сборка — это вычислительная реконструкция полной последовательности из множества коротких прочтений, производимых секвенатором.

Scope

Эта тема охватывает секвенирование по Сэнгеру с использованием дидезоксинуклеотидов, принципы секвенирования нового поколения и секвенирования длинных прочтений, стратегии полногеномного дробовика и клонирования, вычислительную сборку прочтений в контиги и скаффолды, меры качества сборки, такие как покрытие и непрерывность, а также результирующие референсные геномы. В ней рассматривается, как определяется последовательность генома; интерпретация этой последовательности рассматривается в смежных темах.

Core questions

• Как секвенирование по Сэнгеру определяет порядок оснований с использованием терминаторов цепи?
• Что делает секвенирование нового поколения и секвенирование длинных прочтений быстрее и дешевле, и каковы их компромиссы?
• Как миллионы перекрывающихся прочтений собираются в хромосомы?
• Что говорят нам меры покрытия и непрерывности о качестве сборки?

Key concepts

• Секвенирование по Сэнгеру с использованием дидезоксинуклеотидов
• Секвенирование нового поколения и секвенирование длинных прочтений
• Стратегия полногеномного дробовика
• Сборка прочтений: контиги и скаффолды
• Покрытие, непрерывность и референсные геномы

Mechanisms

Секвенирование по Сэнгеру использует дидезоксинуклеотиды, обрывающие цепь, для генерации лестницы фрагментов, длины которых раскрывают последовательность; массово-параллельные платформы считывают миллионы фрагментов одновременно, а программное обеспечение для сборки обнаруживает перекрытия между прочтениями, чтобы объединить их в контиги, упорядочивая и ориентируя их в скаффолды вдоль каждой хромосомы.

Clinical relevance

Доступное секвенирование сделало полногеномное и экзомное секвенирование рутинным для диагностики редких наследственных заболеваний, профилирования опухолей, идентификации патогенов и скрининга новорожденных, превратив определение последовательности из знакового проекта в стандартный лабораторный тест.

History

Сэнгер представил секвенирование с обрывом цепи в 1977 году, Проект «Геном человека» применил стратегии клонирования по клону и дробовика для получения чернового варианта генома человека в 2001 году, а появление секвенирования нового поколения в середине 2000-х годов, за которым последовали платформы для длинных прочтений, снизило стоимость секвенирования генома человека с миллиардов долларов до нескольких сотен.

Key figures

• Frederick Sanger
• Eric Lander
• Craig Venter

Seminal works

• sanger1977
• lander2001

Frequently asked questions

Почему геном должен быть собран, а не просто прочитан насквозь?

Инструменты секвенирования могут считывать лишь короткие участки ДНК за раз, поэтому геном разбивается на бесчисленные фрагменты; затем программное обеспечение для сборки реконструирует исходный порядок, обнаруживая, где фрагменты перекрываются.

Что означает покрытие при секвенировании?

Покрытие — это среднее количество раз, которое считывается каждое основание в геноме; более высокое покрытие дает большую уверенность в каждом вызове и помогает отличить истинные варианты от ошибок секвенирования.