Технологии секвенирования нового поколения

Секвенирование нового поколения (NGS), также называемое высокопроизводительным или массово-параллельным секвенированием, относится к платформам, которые считывают от миллионов до миллиардов фрагментов ДНК одновременно, вытесняя метод Сэнгера, при котором считывание происходит по одному фрагменту за раз. Эти технологии снизили стоимость секвенирования на порядки и сделали рутинными исследования целых геномов, экзомов и транскриптомов.

Definition

Технологии секвенирования нового поколения — это платформы, которые определяют нуклеотидную последовательность путем параллельного считывания очень большого числа фрагментов ДНК, производя высокопроизводительные данные с низкой стоимостью за основание, в отличие от последовательного электрофоретического считывания при секвенировании по Сэнгеру.

Scope

Статья рассматривает семейства высокопроизводительных платформ, включая секвенирование по синтезу с короткими прочтениями и одномолекулярные подходы с длинными прочтениями, такие как нанопоровое и одномолекулярное секвенирование в реальном времени, компромиссы между длиной прочтения и точностью, которые их отличают, а также их влияние на масштаб геномики. Это методологический обзор, а не сравнение для принятия решений о покупке или клиническом тестировании.

Core questions

• Что отличает секвенирование нового поколения от более раннего секвенирования по Сэнгеру?
• Чем отличаются платформы с короткими и длинными прочтениями по длине прочтения, точности и областям применения?
• Как высокопроизводительное секвенирование изменило масштаб и стоимость геномики?

Key concepts

• Массово-параллельное секвенирование
• Секвенирование по синтезу
• Платформы с короткими и длинными прочтениями
• Одномолекулярное секвенирование в реальном времени
• Нанопоровое секвенирование
• Компромисс между длиной прочтения и точностью на основание
• Стоимость на основание

Mechanisms

Высокопроизводительные платформы иммобилизуют и считывают огромное количество фрагментов ДНК одновременно. Секвенирование по синтезу с короткими прочтениями детектирует каждое основание по мере его включения, часто используя обратимые терминаторы, что дает короткие, но очень точные прочтения. Подходы с длинными прочтениями считывают отдельные молекулы в реальном времени или по мере их прохождения через нанопору, производя гораздо более длинные прочтения, которые охватывают повторяющиеся и структурно сложные регионы, ценой несколько более высокой ошибки на основание. Выбор между платформами отражает компромисс между длиной прочтения, точностью, пропускной способностью и стоимостью, который зависит от аналитической цели.

Clinical relevance

Секвенирование нового поколения является основным инструментом современной геномной и клинической геномики, позволяя проводить все — от обнаружения вариантов до геномики патогенов и рака. Эта статья описывает технологии и их компромиссы в качестве справочного материала и не рекомендует какую-либо конкретную платформу или тест для индивидуального использования.

Evidence & guidelines

Область документирована влиятельными обзорами, прослеживающими эволюцию платформ: Metzker (2010), Reuter et al. (2015) и Goodwin et al. (2016) для общего обзора, и Wang et al. (2021) специально для нанопорового секвенирования; Bentley et al. (2008) является основополагающим первичным отчетом по коротким прочтениям.

History

После того как секвенирование по Сэнгеру доминировало в течение трех десятилетий, коммерческие массово-параллельные платформы появились в середине 2000-х годов, а секвенирование по синтезу с обратимыми терминаторами и короткими прочтениями было продемонстрировано в масштабе всего генома в 2008 году. В течение следующего десятилетия пропускная способность резко возросла, а затраты резко снизились, в то время как одномолекулярные платформы с длинными прочтениями (одномолекулярное секвенирование в реальном времени и нанопоровое секвенирование) созрели для решения проблем, связанных с ограничениями длины коротких прочтений.

Key figures

• Michael Metzker
• Michael Snyder
• W. Richard McCombie
• David Bentley

Seminal works

• metzker-2009
• goodwin-2016
• wang-2021

Frequently asked questions

Что добавляет секвенирование нового поколения по сравнению с секвенированием по Сэнгеру?

Оно считывает от миллионов до миллиардов фрагментов параллельно, а не по одному за раз, увеличивая пропускную способность на многие порядки и снижая стоимость, что делает практичными исследования целых геномов и популяционные исследования.

Каков основной компромисс между секвенированием с короткими и длинными прочтениями?

Короткие прочтения обычно очень точны, но слишком коротки, чтобы охватывать длинные повторы, в то время как длинные прочтения охватывают повторяющиеся и структурно сложные области, но исторически имели более высокие показатели ошибок на основание.